黃志深，王 慶，吳斯宇，周文禮，王英英，尹紀元，李瑩瑩

(1.天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津 300384；2.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁藥創(chuàng)制重點實驗室/廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣州 510380)

草魚(Ctenopharyngodonidella)是我國重要的淡水魚養(yǎng)殖品種，2019年全國草魚產(chǎn)量為553.31萬噸，占全國淡水魚總產(chǎn)量的21.72%。2020年中國水生動物衛(wèi)生狀況報告顯示，草魚因病害問題造成的經(jīng)濟損失約為25.8億元，其中草魚出血病是引起草魚發(fā)病并造成巨大損失的主要原因之一，嚴重制約了草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康、持續(xù)發(fā)展[1,2]。草魚呼腸孤病毒(GCRV)隸屬水生呼腸孤病毒屬(Aquareoviridae)，是中國分離的第一種魚類病毒，目前己經(jīng)報道了30多個分離株。該病毒主要引起草魚在魚種階段發(fā)生出血病，死亡率可高達80%以上[3-5]。已知的GCRV可分為I、Ⅱ、Ⅲ三個基因型，其中Ⅱ型GCRV是目前主要流行型[5-8]。GCRV-Ⅱ型強毒株對草魚致病性強，但對細胞敏感性弱，在目前已有細胞系上均不能產(chǎn)生明顯的細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，對Ⅱ型GCRV致病機理研究造成很大的阻礙。因此，目前對Ⅱ型GCRV的致病機理研究仍然處于初級階段。

67 kDa LamR是細胞表面蛋白，與層粘連蛋白結(jié)合使細胞粘附在基底膜[9]。目前推測67 kDa LamR 由2個37 kDa的層粘連蛋白受體前體所構(gòu)成，其細胞膜外由蘇氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-色氨酸-絲氨酸重復(fù)(TEDWS repeats)，層粘連蛋白結(jié)合螺旋結(jié)構(gòu)域和G肽(peptide G)構(gòu)成[10]。作為表面受體，67 kDa LamR是很多細菌和病毒的識別位點。最新的研究發(fā)現(xiàn)草魚37 kDa/67 kDa LamR能與草魚呼腸孤病毒VP5蛋白相互作用并促進I型GCRV(GCRV-JX01)的感染[11]。但是否能與Ⅱ型GCRV相互作用對病毒增殖造成影響仍未見報導(dǎo)。本實驗以Ⅱ型GCRV非敏感性細胞EPC、敏感性細胞CIK為材料，構(gòu)建表達草魚37 kDa/67 kDa LamR的穩(wěn)定細胞系，研究草魚37 kDa/67 kDa LamR對Ⅱ型GCRV增殖的影響，為Ⅱ型GCRV的致病機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

細胞培養(yǎng)基M199、胰酶、胎牛血清(FBS)為Gibco公司產(chǎn)品；Trizol Reagent、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司；TaKaRa PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTPs、限制內(nèi)切酶BamHⅠ、限制內(nèi)切酶EcoRⅠ、T4連接酶、pMD19-T購自 TaKaRa公司；G418購自SIGMA公司；pEYFP-Mem質(zhì)粒購自淼靈生物；Ⅱ型GCRV -HuNan1307毒株由本實驗室分離保存；GFP抗體及二抗均購自Bioss公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 pEYFP-Mem-LamR重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過檢索NCBI數(shù)據(jù)庫獲得CiLamR基因(KC825346)的cDNA序列，并根據(jù)pEYFP-Mem的多克隆位點設(shè)計引物LamR-EcoRⅠ-F：5′-TGGAATTCCATGTCCGGAGGTCTGGAT-3′和LamR-BamHⅠ-R：5′-GGTGGATCCGAGACCAGTCGGCAGCGGT-3′(下劃線為酶切位點)。取健康草魚的肝組織，按照Trizol Reagent試劑盒使用說明書進行總RNA的提取，采用TaKaRa PrimeScript RT試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板進行PCR擴增。將上述PCR產(chǎn)物回收純化，與pMD19-T連接及轉(zhuǎn)化，涂布于含氨芐霉素(50 μg/mL)的LB板上篩選鑒定。陽性克隆經(jīng)PCR和酶切鑒定后，送至廣州艾基生物公司測序，序列正確的質(zhì)粒命名為pMD19-T-LamR。將上述質(zhì)粒以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切，與載體pEYFP-Mem連接及轉(zhuǎn)化。陽性克隆經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定后,命名為pEYFP-Mem-CiLamR。

1.3 兩種魚類細胞的G418敏感性試驗

取生長良好的EPC和CIK，用含0.25% EDTA的胰酶消化細胞后，加入含10% FBS的M199培養(yǎng)基將消化的細胞稀釋至濃度約為1.0×106個/mL細胞懸液。吹打均勻后分裝到3塊12孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液1 mL，放置于含5% CO2的28 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待孔內(nèi)細胞長至80%～90%后，棄掉舊培養(yǎng)基，用滅菌的PBS潤洗2次，G418按照0、100、200、300、400、500、600、700、800、900 μg/mL終濃度加入培養(yǎng)板中，每天觀察細胞狀態(tài)，三天更換一次篩選培養(yǎng)基，根據(jù)細胞狀態(tài)確定G418最佳工作濃度。

1.4 穩(wěn)定表達CiLamR的EPC、CIK構(gòu)建

胰酶消化EPC、CIK細胞，將細胞稀釋至濃度約為1.0×106個/mL細胞懸液，吹打均勻后接種到6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，放置于含5% CO2的28 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待孔內(nèi)細胞長至70%～90%后進行轉(zhuǎn)染。實驗分為2組，實驗組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEYFP-Mem-CiLamR，對照組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEYFP-Mem。轉(zhuǎn)染方法按LipofectamineTM2000說明書進行。培養(yǎng)8 h后更換成含10%血清的M199培養(yǎng)基，于28 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光。轉(zhuǎn)染后細胞按1∶4密度傳代培養(yǎng)，待細胞貼壁率達50%～70%時加入G418篩選培養(yǎng)基。篩選10～14 d后，觀察到陽性克隆即停藥培養(yǎng)，多次篩選直到達到80%陽性細胞為止。

1.5 Western blot檢測

胰酶消化穩(wěn)定達CiLamR蛋白、轉(zhuǎn)染空載體、空白對照的EPC和CIK細胞，細胞計數(shù)后分別取1×106個細胞加入200 μL含PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)的RIPA裂解緩沖液(RIPA Lysis Buffer)收樣。加入50 μL 5×蛋白上樣緩沖液，置于100 ℃金屬浴煮沸10 min使蛋白變性，10 000 r/min離心10 min去除細胞碎片。樣品經(jīng)過12%濃度分離膠聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，用Mini Trans-Blot Transfer Cell(Bio-Rad)轉(zhuǎn)移到0.45 μm的硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳37 ℃封閉30 min后，4 ℃孵育商品化抗GFP 兔抗過夜(1∶500倍稀釋)，二抗HRP標記的羊抗兔抗體室溫孵育50 min后顯色。

1.6 病毒接種

胰酶消化CIK-CiLamR-EYFP、CIK-EYFP、EPC-CiLamR-EYFP細胞和EPC-EYFP細胞，加入含10% FBS的M199培養(yǎng)基將消化的細胞稀釋至濃度約為1.0×106個/mL細胞懸液。吹打均勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，放置于含5% CO2的28 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待孔內(nèi)細胞貼壁長至80%～90%后，棄掉舊培養(yǎng)基，用滅菌的PBS潤洗2次，設(shè)置5×106、5×105、5×104、5×103拷貝/μL 4個病毒濃度梯度，每孔加入50 μL病毒液并設(shè)3個重復(fù)和未接毒的對照組，28 ℃孵育1 h，棄病毒液，用滅菌的PBS潤洗2次，加入含5% FBS的M199培養(yǎng)基維持液100 μL/孔，6 d后取樣。

1.7 病毒含量測定

細胞病毒液反復(fù)凍融2次，三個重復(fù)合并為一個梯度樣品，每個梯度樣品取200 μL病毒液用OEMGA的Total RNA Kit I試劑盒提取總RNA，再使用TaKaRa的Prime Script RT Reagent Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，具體步驟均參照試劑盒的說明書進行。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，按照黃琦雯等[12]建立的熒光定量方法測定病毒含量。

2 結(jié)果

2.1 pEYFP-Mem-CiLamR真核表達載體構(gòu)建

以EcoR I和BamH I雙酶切pMD19-T-LamR質(zhì)粒，通過凝膠電泳后回收得到約900 bp CiLamR ORF片段。以pEYFP-Mem-CiLamR為模板，PCR擴增獲得約900 bp條帶(圖1)，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對結(jié)果顯示序列正確。

圖1 質(zhì)粒pEYFP-Mem-CiLamR的PCR和雙酶切鑒定

2.2 EPC、CIK細胞對G418敏感性實驗

設(shè)置不同 G418濃度梯度(見表1)進行EPC、CIK細胞對G418的敏感性實驗。EPC細胞加入G418后第6天，G418終濃度為600、700、800 μg/mL的實驗組，大量EPC細胞死亡，900 μg/mL濃度組細胞全部死亡；第9天，200、300、400、500 μg/mL濃度大量細胞死亡，600、700、800 μg/mL濃度細胞全部死亡；第12天200、300、400 μg/mL濃度細胞全部死亡，因此選取200 μg/mL的G418濃度作為EPC細胞藥物篩選濃度。CIK細胞加入G418后第6天，700、800、900 μg/mL濃度下CIK細胞全部死亡，300、400、500、600 μg/mL濃度大量細胞死亡；第9天200、300、400、500、600 μg/mL濃度全部細胞死亡，100 μg/mL大量死亡，12 d后全部濃度細胞均死亡，因此選取100 μg/mL的G418濃度作為CIK細胞藥物篩選濃度(表1)。

表1 G418敏感性實驗結(jié)果

2.3 穩(wěn)定表達CiLamR細胞系的構(gòu)建

通過多次G418加壓篩選，轉(zhuǎn)染pEYFP-Mem和pEYFP-Mem-CiLamR的EPC、CIK細胞系約有80%的細胞可穩(wěn)定表達EYFP熒光蛋白(圖2)。

圖2 表達pEYFP-Mem和pEYFP-Mem-CiLamR的EPC、CIK細胞

2.4 Western blot檢測CiLamR在EPC、CIK細胞中的表達

取約1×106細胞數(shù)的EPC、CIK、EPC-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem、EPC-pEYFP-Mem-CiLamR、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR細胞系進行Western blot檢測，EPC-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem細胞系在約30 kDa大小處識別到eYFP蛋白，EPC-pEYFP-Mem-CiLamR、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR細胞系在約65 kDa大小處識別到eYFP-CiLamR融合蛋白(圖3)。

圖3 EPC、CIK細胞eYFP-LamR融合蛋白鑒定

2.5 qPCR檢測GCRV-Ⅱ的病毒增殖量

分別以5×106、5×105、5×104、5×103核酸拷貝數(shù)的GCRV-HuNan1307株接種EPC、CIK、EPC-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem、EPC-pEYFP-Mem-CiLamR、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR細胞系，6 d后，EPC-pEYFP-Mem和EPC-pEYFP-Mem-CiLamR細胞系均未檢測出Ⅱ型GCRV。CIK-pEYFP-Mem與CIK-pEYFP-Mem-CiLamR能檢測到Ⅱ型GCRV增殖，但病毒拷貝數(shù)無明顯差異(圖4)。

圖4 Ⅱ型GCRV在CIK-pEYFP-Mem和CIK-pEYFP-Mem-CiLamR細胞增殖情況

3 討論

GCRV是引起草魚出血病的主要原因，其中Ⅱ型GCRV是近幾年流行基因型[13]。由于Ⅱ型GCRV缺乏編碼FAST蛋白的基因，在感染細胞后無法產(chǎn)生細胞融合性CPE[14]。因此Ⅱ型GCRV的病原學研究、疫苗開發(fā)相對滯后，阻礙了病原致病機制、疫苗等防控產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。

多個研究均證明LamR是病原體的重要識別蛋白。Tio等[15]發(fā)現(xiàn)登革病毒血清型1、2和3均能與37 kDa/67 kDa LamR相互作用。37 kDa/67 kDa LamR是辛德畢斯病毒(Sindbis virus)識別并感染細胞的重要蛋白[16]。大腸桿菌K1(E.coliK1)能通過37 kDa/67 kDa LamR進入人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)。呼腸孤病毒主要通過宿主細胞吞噬泡進入細胞，并在溶酶體內(nèi)釋放病毒核酸和功能性蛋白，進而利用宿主細胞營養(yǎng)成分進行自我復(fù)制[17]。而細胞的內(nèi)吞作用又有如網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，胞膜窖介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，巨胞飲作用[18-20]。無論哪一種內(nèi)吞作用都需要膜蛋白激活對應(yīng)的信號，研究發(fā)現(xiàn)LamR、Laminin與補體受體CR1之間的相互作用能引起細胞的內(nèi)吞作用[21]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)LamR通過細胞朊蛋白的內(nèi)化介導(dǎo)網(wǎng)格蛋白有被小窩形成吞噬泡[22,23]。草魚腎臟細胞是GCRV公認的敏感細胞系，李賢等[24]還發(fā)現(xiàn)Ⅱ型GCRV能感染草魚鰾細胞、草魚吻端成纖維細胞等細胞，但無法感染鯉魚上皮細胞、錦鯉腦細胞、鯽腦細胞。使不敏感細胞表達可能的病毒受體蛋白是研究病毒感染細胞途徑的手段之一[25]。本研究擬通過對Ⅱ型GCRV不敏感的EPC表達CiLamR蛋白和對GCRV敏感的CIK細胞過表達CiLamR蛋白，研究CiLamR蛋白是否在Ⅱ型GCRV感染中起重要作用。試驗成功構(gòu)建了表達CiLamR蛋白的EPC和CIK細胞，但是GCRV-Ⅱ不同滴度感染細胞，并未出現(xiàn)病毒增殖量提高的結(jié)果。本實驗結(jié)果初步推測，單獨的CiLamR蛋白與Ⅱ型GCRV不能相互作用引起網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，使非敏感細胞EPC感染Ⅱ型GCRV。推測CiLamR并非Ⅱ型GCRV侵染的決定性受體。根據(jù)研究，與CiLamR相互作用的是GCRV-I的VP5蛋白，但不同基因型GCRV之間VP5蛋白只有18%～23.1%的同源性[11,26]。VP5蛋白間的巨大差異可能是導(dǎo)致CiLamR蛋白無法識別Ⅱ型GCRV的原因?；颌蛐虶CRV的致病機制有待于進一步深入研究。