黃志深，王 慶，吳斯宇，周文禮，王英英，尹紀(jì)元，李瑩瑩

(1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380)

草魚(Ctenopharyngodonidella)是我國(guó)重要的淡水魚養(yǎng)殖品種，2019年全國(guó)草魚產(chǎn)量為553.31萬(wàn)噸，占全國(guó)淡水魚總產(chǎn)量的21.72%。2020年中國(guó)水生動(dòng)物衛(wèi)生狀況報(bào)告顯示，草魚因病害問題造成的經(jīng)濟(jì)損失約為25.8億元，其中草魚出血病是引起草魚發(fā)病并造成巨大損失的主要原因之一，嚴(yán)重制約了草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康、持續(xù)發(fā)展[1,2]。草魚呼腸孤病毒(GCRV)隸屬水生呼腸孤病毒屬(Aquareoviridae)，是中國(guó)分離的第一種魚類病毒，目前己經(jīng)報(bào)道了30多個(gè)分離株。該病毒主要引起草魚在魚種階段發(fā)生出血病，死亡率可高達(dá)80%以上[3-5]。已知的GCRV可分為I、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)基因型，其中Ⅱ型GCRV是目前主要流行型[5-8]。GCRV-Ⅱ型強(qiáng)毒株對(duì)草魚致病性強(qiáng)，但對(duì)細(xì)胞敏感性弱，在目前已有細(xì)胞系上均不能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，對(duì)Ⅱ型GCRV致病機(jī)理研究造成很大的阻礙。因此，目前對(duì)Ⅱ型GCRV的致病機(jī)理研究仍然處于初級(jí)階段。

67 kDa LamR是細(xì)胞表面蛋白，與層粘連蛋白結(jié)合使細(xì)胞粘附在基底膜[9]。目前推測(cè)67 kDa LamR 由2個(gè)37 kDa的層粘連蛋白受體前體所構(gòu)成，其細(xì)胞膜外由蘇氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-色氨酸-絲氨酸重復(fù)(TEDWS repeats)，層粘連蛋白結(jié)合螺旋結(jié)構(gòu)域和G肽(peptide G)構(gòu)成[10]。作為表面受體，67 kDa LamR是很多細(xì)菌和病毒的識(shí)別位點(diǎn)。最新的研究發(fā)現(xiàn)草魚37 kDa/67 kDa LamR能與草魚呼腸孤病毒VP5蛋白相互作用并促進(jìn)I型GCRV(GCRV-JX01)的感染[11]。但是否能與Ⅱ型GCRV相互作用對(duì)病毒增殖造成影響仍未見報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)以Ⅱ型GCRV非敏感性細(xì)胞EPC、敏感性細(xì)胞CIK為材料，構(gòu)建表達(dá)草魚37 kDa/67 kDa LamR的穩(wěn)定細(xì)胞系，研究草魚37 kDa/67 kDa LamR對(duì)Ⅱ型GCRV增殖的影響，為Ⅱ型GCRV的致病機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

細(xì)胞培養(yǎng)基M199、胰酶、胎牛血清(FBS)為Gibco公司產(chǎn)品；Trizol Reagent、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen公司；TaKaRa PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTPs、限制內(nèi)切酶BamHⅠ、限制內(nèi)切酶EcoRⅠ、T4連接酶、pMD19-T購(gòu)自 TaKaRa公司；G418購(gòu)自SIGMA公司；pEYFP-Mem質(zhì)粒購(gòu)自淼靈生物；Ⅱ型GCRV -HuNan1307毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；GFP抗體及二抗均購(gòu)自Bioss公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 pEYFP-Mem-LamR重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得CiLamR基因(KC825346)的cDNA序列，并根據(jù)pEYFP-Mem的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物L(fēng)amR-EcoRⅠ-F：5′-TGGAATTCCATGTCCGGAGGTCTGGAT-3′和LamR-BamHⅠ-R：5′-GGTGGATCCGAGACCAGTCGGCAGCGGT-3′(下劃線為酶切位點(diǎn))。取健康草魚的肝組織，按照Trizol Reagent試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行總RNA的提取，采用TaKaRa PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將上述PCR產(chǎn)物回收純化，與pMD19-T連接及轉(zhuǎn)化，涂布于含氨芐霉素(50 μg/mL)的LB板上篩選鑒定。陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR和酶切鑒定后，送至廣州艾基生物公司測(cè)序，序列正確的質(zhì)粒命名為pMD19-T-LamR。將上述質(zhì)粒以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切，與載體pEYFP-Mem連接及轉(zhuǎn)化。陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定后,命名為pEYFP-Mem-CiLamR。

1.3 兩種魚類細(xì)胞的G418敏感性試驗(yàn)

取生長(zhǎng)良好的EPC和CIK，用含0.25% EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，加入含10% FBS的M199培養(yǎng)基將消化的細(xì)胞稀釋至濃度約為1.0×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液。吹打均勻后分裝到3塊12孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液1 mL，放置于含5% CO2的28 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待孔內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%后，棄掉舊培養(yǎng)基，用滅菌的PBS潤(rùn)洗2次，G418按照0、100、200、300、400、500、600、700、800、900 μg/mL終濃度加入培養(yǎng)板中，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，三天更換一次篩選培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)確定G418最佳工作濃度。

1.4 穩(wěn)定表達(dá)CiLamR的EPC、CIK構(gòu)建

胰酶消化EPC、CIK細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至濃度約為1.0×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液，吹打均勻后接種到6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，放置于含5% CO2的28 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待孔內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)至70%～90%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為2組，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEYFP-Mem-CiLamR，對(duì)照組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEYFP-Mem。轉(zhuǎn)染方法按LipofectamineTM2000說(shuō)明書進(jìn)行。培養(yǎng)8 h后更換成含10%血清的M199培養(yǎng)基，于28 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞按1∶4密度傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁率達(dá)50%～70%時(shí)加入G418篩選培養(yǎng)基。篩選10～14 d后，觀察到陽(yáng)性克隆即停藥培養(yǎng)，多次篩選直到達(dá)到80%陽(yáng)性細(xì)胞為止。

1.5 Western blot檢測(cè)

胰酶消化穩(wěn)定達(dá)CiLamR蛋白、轉(zhuǎn)染空載體、空白對(duì)照的EPC和CIK細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別取1×106個(gè)細(xì)胞加入200 μL含PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)的RIPA裂解緩沖液(RIPA Lysis Buffer)收樣。加入50 μL 5×蛋白上樣緩沖液，置于100 ℃金屬浴煮沸10 min使蛋白變性，10 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片。樣品經(jīng)過12%濃度分離膠聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，用Mini Trans-Blot Transfer Cell(Bio-Rad)轉(zhuǎn)移到0.45 μm的硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳37 ℃封閉30 min后，4 ℃孵育商品化抗GFP 兔抗過夜(1∶500倍稀釋)，二抗HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體室溫孵育50 min后顯色。

1.6 病毒接種

胰酶消化CIK-CiLamR-EYFP、CIK-EYFP、EPC-CiLamR-EYFP細(xì)胞和EPC-EYFP細(xì)胞，加入含10% FBS的M199培養(yǎng)基將消化的細(xì)胞稀釋至濃度約為1.0×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液。吹打均勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，放置于含5% CO2的28 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待孔內(nèi)細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至80%～90%后，棄掉舊培養(yǎng)基，用滅菌的PBS潤(rùn)洗2次，設(shè)置5×106、5×105、5×104、5×103拷貝/μL 4個(gè)病毒濃度梯度，每孔加入50 μL病毒液并設(shè)3個(gè)重復(fù)和未接毒的對(duì)照組，28 ℃孵育1 h，棄病毒液，用滅菌的PBS潤(rùn)洗2次，加入含5% FBS的M199培養(yǎng)基維持液100 μL/孔，6 d后取樣。

1.7 病毒含量測(cè)定

細(xì)胞病毒液反復(fù)凍融2次，三個(gè)重復(fù)合并為一個(gè)梯度樣品，每個(gè)梯度樣品取200 μL病毒液用OEMGA的Total RNA Kit I試劑盒提取總RNA，再使用TaKaRa的Prime Script RT Reagent Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體步驟均參照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，按照黃琦雯等[12]建立的熒光定量方法測(cè)定病毒含量。

2 結(jié)果

2.1 pEYFP-Mem-CiLamR真核表達(dá)載體構(gòu)建

以EcoR I和BamH I雙酶切pMD19-T-LamR質(zhì)粒，通過凝膠電泳后回收得到約900 bp CiLamR ORF片段。以pEYFP-Mem-CiLamR為模板，PCR擴(kuò)增獲得約900 bp條帶(圖1)，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)結(jié)果顯示序列正確。

圖1 質(zhì)粒pEYFP-Mem-CiLamR的PCR和雙酶切鑒定

2.2 EPC、CIK細(xì)胞對(duì)G418敏感性實(shí)驗(yàn)

設(shè)置不同 G418濃度梯度(見表1)進(jìn)行EPC、CIK細(xì)胞對(duì)G418的敏感性實(shí)驗(yàn)。EPC細(xì)胞加入G418后第6天，G418終濃度為600、700、800 μg/mL的實(shí)驗(yàn)組，大量EPC細(xì)胞死亡，900 μg/mL濃度組細(xì)胞全部死亡；第9天，200、300、400、500 μg/mL濃度大量細(xì)胞死亡，600、700、800 μg/mL濃度細(xì)胞全部死亡；第12天200、300、400 μg/mL濃度細(xì)胞全部死亡，因此選取200 μg/mL的G418濃度作為EPC細(xì)胞藥物篩選濃度。CIK細(xì)胞加入G418后第6天，700、800、900 μg/mL濃度下CIK細(xì)胞全部死亡，300、400、500、600 μg/mL濃度大量細(xì)胞死亡；第9天200、300、400、500、600 μg/mL濃度全部細(xì)胞死亡，100 μg/mL大量死亡，12 d后全部濃度細(xì)胞均死亡，因此選取100 μg/mL的G418濃度作為CIK細(xì)胞藥物篩選濃度(表1)。

表1 G418敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 穩(wěn)定表達(dá)CiLamR細(xì)胞系的構(gòu)建

通過多次G418加壓篩選，轉(zhuǎn)染pEYFP-Mem和pEYFP-Mem-CiLamR的EPC、CIK細(xì)胞系約有80%的細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)EYFP熒光蛋白(圖2)。

圖2 表達(dá)pEYFP-Mem和pEYFP-Mem-CiLamR的EPC、CIK細(xì)胞

2.4 Western blot檢測(cè)CiLamR在EPC、CIK細(xì)胞中的表達(dá)

取約1×106細(xì)胞數(shù)的EPC、CIK、EPC-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem、EPC-pEYFP-Mem-CiLamR、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR細(xì)胞系進(jìn)行Western blot檢測(cè)，EPC-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem細(xì)胞系在約30 kDa大小處識(shí)別到eYFP蛋白，EPC-pEYFP-Mem-CiLamR、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR細(xì)胞系在約65 kDa大小處識(shí)別到eYFP-CiLamR融合蛋白(圖3)。

圖3 EPC、CIK細(xì)胞eYFP-LamR融合蛋白鑒定

2.5 qPCR檢測(cè)GCRV-Ⅱ的病毒增殖量

分別以5×106、5×105、5×104、5×103核酸拷貝數(shù)的GCRV-HuNan1307株接種EPC、CIK、EPC-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem、EPC-pEYFP-Mem-CiLamR、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR細(xì)胞系，6 d后，EPC-pEYFP-Mem和EPC-pEYFP-Mem-CiLamR細(xì)胞系均未檢測(cè)出Ⅱ型GCRV。CIK-pEYFP-Mem與CIK-pEYFP-Mem-CiLamR能檢測(cè)到Ⅱ型GCRV增殖，但病毒拷貝數(shù)無(wú)明顯差異(圖4)。

圖4 Ⅱ型GCRV在CIK-pEYFP-Mem和CIK-pEYFP-Mem-CiLamR細(xì)胞增殖情況

3 討論

GCRV是引起草魚出血病的主要原因，其中Ⅱ型GCRV是近幾年流行基因型[13]。由于Ⅱ型GCRV缺乏編碼FAST蛋白的基因，在感染細(xì)胞后無(wú)法產(chǎn)生細(xì)胞融合性CPE[14]。因此Ⅱ型GCRV的病原學(xué)研究、疫苗開發(fā)相對(duì)滯后，阻礙了病原致病機(jī)制、疫苗等防控產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。

多個(gè)研究均證明LamR是病原體的重要識(shí)別蛋白。Tio等[15]發(fā)現(xiàn)登革病毒血清型1、2和3均能與37 kDa/67 kDa LamR相互作用。37 kDa/67 kDa LamR是辛德畢斯病毒(Sindbis virus)識(shí)別并感染細(xì)胞的重要蛋白[16]。大腸桿菌K1(E.coliK1)能通過37 kDa/67 kDa LamR進(jìn)入人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)。呼腸孤病毒主要通過宿主細(xì)胞吞噬泡進(jìn)入細(xì)胞，并在溶酶體內(nèi)釋放病毒核酸和功能性蛋白，進(jìn)而利用宿主細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行自我復(fù)制[17]。而細(xì)胞的內(nèi)吞作用又有如網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，胞膜窖介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，巨胞飲作用[18-20]。無(wú)論哪一種內(nèi)吞作用都需要膜蛋白激活對(duì)應(yīng)的信號(hào)，研究發(fā)現(xiàn)LamR、Laminin與補(bǔ)體受體CR1之間的相互作用能引起細(xì)胞的內(nèi)吞作用[21]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)LamR通過細(xì)胞朊蛋白的內(nèi)化介導(dǎo)網(wǎng)格蛋白有被小窩形成吞噬泡[22,23]。草魚腎臟細(xì)胞是GCRV公認(rèn)的敏感細(xì)胞系，李賢等[24]還發(fā)現(xiàn)Ⅱ型GCRV能感染草魚鰾細(xì)胞、草魚吻端成纖維細(xì)胞等細(xì)胞，但無(wú)法感染鯉魚上皮細(xì)胞、錦鯉腦細(xì)胞、鯽腦細(xì)胞。使不敏感細(xì)胞表達(dá)可能的病毒受體蛋白是研究病毒感染細(xì)胞途徑的手段之一[25]。本研究擬通過對(duì)Ⅱ型GCRV不敏感的EPC表達(dá)CiLamR蛋白和對(duì)GCRV敏感的CIK細(xì)胞過表達(dá)CiLamR蛋白，研究CiLamR蛋白是否在Ⅱ型GCRV感染中起重要作用。試驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)CiLamR蛋白的EPC和CIK細(xì)胞，但是GCRV-Ⅱ不同滴度感染細(xì)胞，并未出現(xiàn)病毒增殖量提高的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步推測(cè)，單獨(dú)的CiLamR蛋白與Ⅱ型GCRV不能相互作用引起網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，使非敏感細(xì)胞EPC感染Ⅱ型GCRV。推測(cè)CiLamR并非Ⅱ型GCRV侵染的決定性受體。根據(jù)研究，與CiLamR相互作用的是GCRV-I的VP5蛋白，但不同基因型GCRV之間VP5蛋白只有18%～23.1%的同源性[11,26]。VP5蛋白間的巨大差異可能是導(dǎo)致CiLamR蛋白無(wú)法識(shí)別Ⅱ型GCRV的原因?；颌蛐虶CRV的致病機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。