楊 冬，王麗峰，張 穎，溫都蘇

1.廉江市人民醫(yī)院婦科，廣東 廉江 524400；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 湛江 524023

腹腔鏡手術(shù)因其獨(dú)特的開腹手術(shù)不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，在婦科手術(shù)領(lǐng)域得到廣泛的開展，并逐漸成為主流方式。隨著手術(shù)醫(yī)生操作技巧的不斷提高、腹腔鏡手術(shù)器械的日益改善，避免術(shù)后因手術(shù)原因造成的癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移成為研究熱點(diǎn)。CO2氣腹進(jìn)入視野，部分報(bào)道認(rèn)為CO2氣腹可能引發(fā)惡性腫瘤的種植性［1］。CO2氣腹通過直接的細(xì)胞外環(huán)境的缺氧及血流動力學(xué)方面的影響導(dǎo)致了腹腔內(nèi)缺血、腹腔局部缺氧［2］。依據(jù)Hanly等［3］的研究結(jié)果腹膜局部微環(huán)境的改變源于腹膜對CO2氣體的吸收、腹膜局部免疫力的下降。Nordgren等［4］認(rèn)為，腫瘤耐受缺氧環(huán)境得以繁殖是其存活的根本。部分專家、學(xué)者認(rèn)為，以CO2為氣腹介質(zhì)的腹腔鏡通過煙霧化作用、煙囪效應(yīng)、腫瘤細(xì)胞的穿刺孔直接污染等增加盆腹腔惡性腫瘤在腫瘤細(xì)胞腹腔內(nèi)侵襲、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)［5-9］，相應(yīng)的增加卵巢癌的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)［10］。本次試驗(yàn)以裸鼠卵巢癌移植瘤為研究對象，對照標(biāo)本中自噬基因Beclin1在CO2氣腹作用后的變化情況探討對癌細(xì)胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 裸鼠卵巢癌移植瘤標(biāo)本的獲得：將SPF等級BALB／c／nu裸小鼠40只（雌性，7～8周齡），恒溫飼養(yǎng)，人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞系SKOV3（購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究細(xì)胞庫），細(xì)胞培養(yǎng)后接種于裸鼠，要求每個(gè)裸鼠接種細(xì)胞數(shù)量一致，飼養(yǎng)成瘤后成瘤。隨機(jī)分四組：（1）對照組：10只雌性裸鼠鼠；（2）開腹組：10只雌性裸鼠開腹手術(shù)維持30 min；（3）氣腹0.5 h組：10只雌性裸鼠氣腹維持30 min；（4）氣腹0.5 h組：10只雌性裸鼠氣腹維持30 min。集體處死，收集各組中裸鼠腹腔內(nèi)生長的移植瘤標(biāo)本，取標(biāo)本甲醛固定及80℃冰箱。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)器材：液氮罐、電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽、Western blot曝光系統(tǒng)、Eppendorf 5417R冷凍離心機(jī)、XW-80A旋渦混合器、凝膠成像分析系統(tǒng)UVPM-20、逆轉(zhuǎn)錄PCR儀（Mastercycler gradient）、雙目生物顯微鏡Nikon YS100。

1.1.3 主要試劑：（1）實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑：Total RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒、Beclin1 PCR引物、無水乙醇、氯仿、DEPC（焦碳酸二乙酯）、異丙醇、瓊脂糖等。（2）免疫組化相關(guān)試劑：兔抗人Beclin1單克隆抗體（美國Abcam公司）、二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、中性樹膠、蘇木素等均購置于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；檸檬酸二鈉、PBS、檸檬酸、二甲苯等。（3）Western blot主要試劑：兔抗人Beclin1單克隆抗體（美國Abcam公司）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、組織裂解液、Bradford蛋白定量試劑盒、蛋白Marker、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（BeyoECL Plus）、1.0M Tris-Hcl（PH6.8）、1.5M Tris-Hcl（PH8.8）、5×蛋白上樣緩沖液、N-N亞甲基雙丙烯酰胺、Tris-base、過硫酸銨、SDS、丙烯酰胺、TEMED、甘氨酸等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

圖1 裸鼠卵巢癌組織中的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2（上）融曲線；（下）融解峰

圖3 擴(kuò)增曲線

1.2.2 免疫組化：（1）試驗(yàn)操作 對40例標(biāo)本石蠟固定后行二步法免疫組化檢測，一抗選擇Beclin1（美Abcam公司1:2 000稀釋）。（2）免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)Beclin1相應(yīng)蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿中，可被染成淺黃色、棕黃色或是棕褐色。取每張切片中表染色最強(qiáng)的部分，按著色程度進(jìn)行評分。0分：基本未著色，染色與背景相似；1分：著色淺，染色略高于背景；2分：中度著色，明顯高于背景；3分：強(qiáng)染，染成深棕黃色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)200倍鏡視野，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分，陽性細(xì)胞數(shù)小于5%者為0，陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%計(jì)1分；26%～50%計(jì)2分；51%～75%計(jì)3分；76%～100%計(jì)4分。將以上兩種評分相加，積分為0～1分，表示陰性（“—”）；積分為2～3分，表示弱陽性（+）：積分為4～5分，表示中陽性（++）；積分為6～7分，表示強(qiáng)陽性（+++）。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）：各組分別提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，制備上樣，PAGE電泳膠制備根據(jù)Beclin1、GAPDH蛋白的分子量（52 kDa、36 kDa）分別選用8%和12%的分離膠和5%的聚丙烯酰胺凝膠（濃縮膠），電泳、轉(zhuǎn)模、免疫印跡。結(jié)果采用用AlphaView軟件進(jìn)行灰度值分析，以內(nèi)參GAPDH的灰度值為標(biāo)準(zhǔn)，目的蛋白所得的灰度值與內(nèi)參灰度值相比得出相對灰度值，繪制圖表。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

Beclin1 mRNA在對照組、開腹組、CO2氣腹0.5 h組及CO2氣腹1 h組裸鼠卵巢癌移植瘤組織中表達(dá)呈遞減趨勢，且在CO2氣腹1 h組下降最為明顯（圖4）。四組進(jìn)行單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。對照組與開腹組、CO2氣腹0.5 h組與CO2氣腹1 h組組間兩兩比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而CO2氣腹0.5 h或氣腹1 h組與對照組或開腹組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖4 Beclin1在四組組織中的相對表達(dá)量比較

表1 Beclin1在四組組織中的相對表達(dá)量及組間比較結(jié)果

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 HE染色：從40例標(biāo)本中各取1張石蠟切片進(jìn)行HE染色，確定所取標(biāo)本均為卵巢癌組織（圖5）。

圖5 HE染色（20×）

2.2.2 Beclin1在裸鼠卵巢癌組織中的表達(dá)情況：Beclin1在四組裸鼠卵巢癌移植瘤組織中的表達(dá)情況見表2、圖6。由于各組間陽性表達(dá)率差異不明顯，本實(shí)驗(yàn)選擇評分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。從表中可以看出，Beclin1在四組組織中的陽性表達(dá)率無明顯差別，表達(dá)強(qiáng)度評分雖有逐漸下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 A:陰性對照（PBS代替一抗）；B：弱陽性表達(dá)；C：中陽性表達(dá)；D：強(qiáng)陽性表達(dá)（20×）

表2 Beclin1蛋白在裸鼠卵巢癌移植瘤組織中的表達(dá)情況

2.3 Western blot結(jié)果

Beclin1在四組組織中的表達(dá)呈逐漸降低，在CO2氣腹1 h組下降尤為明顯（見圖7），單因素方差分析顯示四組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，對照組、開腹組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；CO2氣腹0.5 h組與CO2氣腹1 h組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）而CO2氣腹0.5 h或氣腹1 h組與對照組或開腹組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與RT-PCR結(jié)果一致，見表3。

表3 Beclin1相應(yīng)蛋白在四組組織中的相對表達(dá)量及組間比較結(jié)果

圖7 Beclin1相應(yīng)蛋白在四組組織中的相對表達(dá)

3 討論

CO2氣腹對術(shù)后癌癥轉(zhuǎn)移及再發(fā)癌癥的影響提上日程，體外研究發(fā)現(xiàn)，CO2氣腹通過上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞因子CXCLl2、CXCR4、nm23-H1、MMP-2、VEGF、VEGFR-2等促進(jìn)卵巢癌的轉(zhuǎn)移［11-13］。而女性生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生（諸如乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌）中，自噬作為細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的缺陷可導(dǎo)致上述腫瘤的發(fā)生。癌基因或抑癌基因通過自噬途徑改變其活性。CO2氣腹的體外模擬環(huán)境下自噬的改變對卵巢癌的轉(zhuǎn)移是否促進(jìn)目前正在進(jìn)一步的研究當(dāng)中。部分研究表明，高壓力CO2氣腹產(chǎn)生的機(jī)械性壓迫和代謝影響呼吸、循環(huán)、消化、神經(jīng)內(nèi)分泌等，同時(shí)氣腹壓力的增加可導(dǎo)致腫瘤的種植性轉(zhuǎn)移。

作為自噬的啟動蛋白越來越多的證據(jù)表明，Beclin1表達(dá)可能是自噬的“守門人”。Beclin1通過激活PI3K III/Vps34通路以介導(dǎo)自噬的正性調(diào)節(jié)，是調(diào)控自噬的一個(gè)必需的基因。在人乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中觀察到高頻率的Beclin1等位基因的缺失。Liang等［14］的研究表明乳腺癌組織中Beclin1呈低表達(dá)或無表達(dá)，在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，Beclin1表達(dá)下降，并幾乎檢測不到。在對卵巢癌的研究中，Laudanski等［15］收集的卵巢癌標(biāo)本中Beclin1的表達(dá)較良性腫瘤中的表達(dá)下調(diào)。Qu等［16］發(fā)現(xiàn)，40%～70%的卵巢癌中有自噬相關(guān)基因Beclin1缺失。免疫組化對比研究顯示：Beclin1在上皮性卵巢癌中的表達(dá)明顯低于良性卵巢腫瘤組織和鄰近非腫瘤組織段振玲［17］、Shen［18］，同時(shí)研究顯示其表達(dá)水平與卵巢癌的分化程度、組織學(xué)分型、FIGO分期呈負(fù)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)的研究中僅就模擬腹腔鏡下的缺血缺氧環(huán)境表達(dá)其對Beclin1的影響。本實(shí)驗(yàn)中：（1）Beclin1在CO2氣腹0.5 h組、CO2氣腹1 h組的表達(dá)量與對照組及相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因多項(xiàng)研究表明Beclin1屬抑癌基因，其表達(dá)下調(diào)說明腫瘤在CO2氣體處理后增殖能力加強(qiáng)。（2）CO2氣腹0.5 h組、CO2氣腹1 h組中Beclin1的表達(dá)兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CO2氣腹對腫瘤的增殖的影響在Beclin1介導(dǎo)的自噬途徑上無明顯時(shí)間差異性。故CO2氣體可通過Beclin1的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。CO2氣體造成的缺氧環(huán)境可抑制Beclin1的表達(dá)，使Beclin1表達(dá)降低。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測裸鼠建立的人卵巢癌移植瘤動物模型中自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)情況，并對比CO2氣腹作用后Beclin1的表達(dá)差異來反應(yīng)CO2氣腹作用后卵巢癌細(xì)胞的增殖情況，初步評估CO2氣腹通過自噬途徑對卵巢癌細(xì)胞生長的影響。依據(jù)研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，CO2氣腹可能通過影響B(tài)eclin1的表達(dá)進(jìn)而影響自噬的發(fā)生，通過下調(diào)Beclin1的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移，這種影響與CO2氣腹作用時(shí)間無明顯直接聯(lián)系。

研究缺血、缺氧機(jī)制僅作為腹腔鏡手術(shù)的一部分為臨床手術(shù)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是否可以通過相應(yīng)條件的阻斷仍需不斷的研究。其最終目的在于通過不斷研究和改進(jìn)為腹腔鏡手術(shù)能夠很好地服務(wù)于卵巢癌患者提供相關(guān)依據(jù)及減低術(shù)后轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。