李圣橈，李若萌，陳博樸，張 衛(wèi)，周亞軍

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062）

吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)藍(lán)靛果資源豐富、價(jià)格低廉，果實(shí)中含有大量的維C、氨基酸及黃酮類(lèi)物質(zhì)，提取物中花青素含量較高。其可被加工成藍(lán)靛果飲料、果醬等產(chǎn)品銷(xiāo)售，但因其味苦澀使其難以被接受，且加工中產(chǎn)生的皮渣被當(dāng)作廢棄物扔掉，造成資源浪費(fèi)?；ㄇ嗨兀ˋnthocyanidin）是一種存在于植物中的水溶性色素，具有抗氧化活性、抗病毒和防治心血管疾病等功能[1]，可以幫助食品著色，對(duì)糖尿病等多種疾病的防治都有著顯著成效[2]。

長(zhǎng)期以來(lái)，花青素的提取工藝較多采用傳統(tǒng)溶劑浸提法，但由于其存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低、操作復(fù)雜等問(wèn)題，難以滿(mǎn)足當(dāng)今工業(yè)化需求。為尋求較為高效、快捷的提取方法，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究，并在超聲波[3]、微波[4]、高壓脈沖電場(chǎng)[5]等物理手段輔助提取法方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在成本高、對(duì)提取物有破壞性等問(wèn)題，因此未達(dá)到理想的提取效果。超高壓輔助提取技術(shù)（Ultra-high pressure-assisted extraction，UHP）是以水或其他流體為媒介，將處理樣品在100 MPa以上壓力下保持一段時(shí)間，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞、目標(biāo)產(chǎn)物得以充分釋放的一種新型提取技術(shù)[6]。李鵬等人[7]利用超高壓輔助提取桑葚花色苷并對(duì)其抗氧化活性研究。楊孝輝等人[8]利用超高壓提取不同植物中的多糖。葉陳麗等人[9]利用超高壓技術(shù)提取金銀花中的綠原酸，但超高壓輔助提取藍(lán)靛果中花青素未見(jiàn)報(bào)道。采用超高壓輔助提取藍(lán)靛果中的花青素，并優(yōu)化其工藝參數(shù)。以期為藍(lán)靛果深加工開(kāi)辟新途徑，為花青素的高效提取提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)靛果，吉林省延吉市二道白河鎮(zhèn)長(zhǎng)白工坊生態(tài)產(chǎn)品有限公司提供?；瘜W(xué)試劑：鹽酸、氯化鉀、冰醋酸，分析純；無(wú)水乙醇（食品級(jí)），均為北京化工廠提供。

1.2 儀器與試劑

BCD-180TMP型冷藏冷凍冰箱，海爾公司產(chǎn)品；PHSJ-4F型pH計(jì)，上海禹昂自動(dòng)化科技公司產(chǎn)品；HPP600MPa/40L型超高壓食品處理裝置，包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TU-1800型紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器公司產(chǎn)品；PTF-A+200型電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；H2-16KR型高速冷凍離心機(jī)，湖南長(zhǎng)沙可成儀器設(shè)備有限責(zé)任公司產(chǎn)品；YTLG-10A型真空冷凍干燥機(jī)，上海葉拓科技有限公司產(chǎn)品；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，蘇州威爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；THC-100型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海容威儀器有限公司產(chǎn)品；XL-02A型手提式粉碎機(jī)，杭州旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 超高壓輔助提取工藝流程

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）藍(lán)靛果粉末制備。將藍(lán)靛果通過(guò)凍干機(jī)干燥后粉碎成粉末、1 mm過(guò)篩，密封后置于干燥環(huán)境中貯藏備用。

（2）超高壓處理。取藍(lán)靛果粉末樣品于燒杯中，根據(jù)乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比加入乙醇溶液，對(duì)其進(jìn)行均質(zhì)得到更均勻的樣品液。改變壓力和保壓時(shí)間等設(shè)備參數(shù)對(duì)樣品液進(jìn)行處理[10]。

（3）離心。提取液放入高速冷凍離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心12 min。

（4）測(cè)定吸光度。取上清液，分別用pH值4.5和1.0的緩沖溶液稀釋、搖勻，用蒸餾水作對(duì)照，于35℃下恒溫水浴30 min，于最大波長(zhǎng)和700 nm處分別測(cè)其吸光度。

1.4 花青素含量檢測(cè)方法

花青素含量用pH值示差法檢測(cè)，通過(guò)紫外分光光度法計(jì)算求值，計(jì)算公式（1）。

式中：A-(A512-A700nm)pH1.0-(A512-A700nm)pH4.5；

Mw——分子量，449 g/mol；

V——提取液總?cè)莘e，mL；

n——樣品稀釋倍數(shù)；

ε——消光系數(shù)，26 900 L·mol-·1cm-1；

b——光程數(shù)，1 cm；

m——原料的質(zhì)量，g。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 預(yù)試驗(yàn)及傳統(tǒng)溶劑浸提工藝優(yōu)化

對(duì)傳統(tǒng)溶劑提取法及超高壓提取法提取花青素進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，剔除無(wú)關(guān)變量，為進(jìn)一步試驗(yàn)做準(zhǔn)備。通過(guò)研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)傳統(tǒng)溶劑浸提法提取花青素含量的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)得出最佳工藝參數(shù)。

1.5.2 超高壓輔助提取花青素單因素試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選壓力、保壓時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)這3個(gè)因素進(jìn)行超高壓輔助提取花青素單因素試驗(yàn)，研究其對(duì)花青素提取量的影響。

超高壓提取花青素因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 超高壓提取花青素因素與水平設(shè)計(jì)

1.5.3 超高壓輔助提取花青素響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)花青素提取量影響顯著的壓強(qiáng)（X）1、保壓時(shí)間（X）2、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X）33個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化出超高壓輔助提取花青素工藝的最佳參數(shù)。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)變量與編碼見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)變量與編碼

1.5.4 對(duì)比試驗(yàn)

將超高壓輔助提取法與傳統(tǒng)溶劑浸提法最佳提取工藝參數(shù)與最大提取量進(jìn)行對(duì)比分析，確定提取方法。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果為重復(fù)測(cè)定3次的平均值，用Origin 9.1和SPSS 20.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行Anova和Duncan多重比較統(tǒng)計(jì)分析，用Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取制備的含花青素提取液，置于紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行190～900 nm全波長(zhǎng)掃描。

藍(lán)靛果花青素提取液光譜掃描曲線圖見(jiàn)圖1。

由圖1可知，掃描光譜曲線呈平滑拋物線狀，最大波峰為512 nm，故確定512 nm為花青素的最大吸收波長(zhǎng)。

圖1 藍(lán)靛果花青素提取液光譜掃描曲線圖

2.2 壓強(qiáng)對(duì)花青素提取量的影響

在料液比1∶30，保壓時(shí)間3 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%的條件下，研究壓強(qiáng)對(duì)花青素提取量的影響。

壓強(qiáng)對(duì)花青素提取量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 壓強(qiáng)對(duì)花青素提取量的影響

由圖2可知，壓強(qiáng)低于250 MPa時(shí)，增大壓強(qiáng)，花青素提取量顯著提高（p＜0.05）；壓強(qiáng)達(dá)到250 MPa，增大壓強(qiáng)，提取量顯著降低（p＜0.05）。譚佳琪等人[10]提取桑葚花色苷時(shí)也觀察到了相似趨勢(shì)。其原因可能是一定壓力值會(huì)使細(xì)胞器、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受損，細(xì)胞滲透能力增加，有利于提取溶劑進(jìn)入細(xì)胞，促進(jìn)藍(lán)靛果中有效成分滲透到細(xì)胞外，提高花青素的提取率[11]。因此，最佳作用壓強(qiáng)選250 MPa。

2.3 保壓時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響

在壓強(qiáng)250 MPa，料液比1∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%的條件下，研究保壓時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響。

保壓時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 保壓時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響

由圖3可知，在保壓時(shí)間小于3 min時(shí)，花青素提取量隨保壓時(shí)間的增加而顯著增加（p＜0.05），當(dāng)保壓時(shí)間達(dá)到3 min后，增大保壓時(shí)間花青素提取量顯著降低（p＜0.05）。與杜月嬌等人[12]在提取山葡萄花青素試驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致。因?yàn)樗{(lán)靛果細(xì)胞隨著保壓時(shí)間延長(zhǎng)而破裂，目標(biāo)成分被提取出來(lái)，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)促進(jìn)酶促反應(yīng)進(jìn)行，導(dǎo)致花青素降解，使提取率降低。因此，最佳保壓時(shí)間選3 min。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取量的影響

在壓強(qiáng)250 MPa，料液比1∶30，保壓時(shí)間3 min的條件下，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取量的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取量的影響

由圖4可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～40%時(shí)，花青素提取量顯著增大（p＜0.05），并于乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)達(dá)到最大，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%后，繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，花青素提取量顯著降低（p＜0.05）。王鑫等人[13]利用超高壓提取藍(lán)莓花青素得到了類(lèi)似的結(jié)果。原因可能是花青素屬于黃酮類(lèi)物質(zhì)，在乙醇中的溶解性較好，隨著其體積分?jǐn)?shù)增大，花青素溶出率增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大后，使溶液極性降低，花青素溶解性隨之降低且易發(fā)生醇降現(xiàn)象，不利于花青素的提取。因此，乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)選為40%。

2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

花青素提取量Y與壓強(qiáng)（X）1、保壓時(shí)間（X）2和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X）33個(gè)因素的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6 回歸模型建立及方差分析

對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得響應(yīng)變量與響應(yīng)值間的二次回歸方程：

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

二次回歸模型的方差分析見(jiàn)表4。

由表4可知，數(shù)學(xué)模型F=36.79，p＜0.000 1，說(shuō)明回歸模型極為顯著；失擬項(xiàng)F=0.755 2＞0.05，說(shuō)明方程擬合良好；決定系數(shù)R2=0.979 4，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.952 6，說(shuō)明響應(yīng)值與自變量間線性關(guān)系顯著，模型可信度較高。該模型可用于解釋花青素提取量的變化。

表4 二次回歸模型的方差分析

2.7 響應(yīng)面分析

通過(guò)軟件Design Expert 8.0.6分析得壓強(qiáng)與保壓時(shí)間、壓強(qiáng)與乙醇體積分?jǐn)?shù)、保壓時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用。

保壓時(shí)間與壓強(qiáng)交互作用及等高線圖見(jiàn)圖6，乙醇體積分?jǐn)?shù)與壓強(qiáng)交互作用及等高線圖見(jiàn)圖7，乙醇體積分?jǐn)?shù)與保壓時(shí)間交互作用及等高線圖見(jiàn)圖8。

由圖6可知，響應(yīng)曲面較陡，表明花青素提取量受二因素影響顯著；二者軸向等高線分布均勻，呈橢圓狀，交互作用較強(qiáng)。由圖7可知，響應(yīng)曲面較陡，花青素提取量受兩因素影響顯著；等高線呈橢圓狀，二者交互作用較強(qiáng)。由圖8可知，響應(yīng)曲面較陡，花青素提取量受二因素影響較大；二者軸向等高線呈橢圓狀并均勻分布，二者交互作用顯著。但是，由方差分析可知，壓強(qiáng)和保壓時(shí)間、壓強(qiáng)和乙醇體積分?jǐn)?shù)、保壓時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用均對(duì)花青素含量的影響并不顯著。

圖6 保壓時(shí)間與壓強(qiáng)交互作用及等高線圖

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與壓強(qiáng)交互作用及等高線圖

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)與保壓時(shí)間交互作用及等高線圖

2.8 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證

超高壓提取藍(lán)靛果花青素最佳工藝為壓強(qiáng)260.5 MPa，保壓時(shí)間3.5 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)33.1%，此時(shí)花青素提取量理論最大值為36.31 mg/g。考慮實(shí)際操作，對(duì)工藝適當(dāng)調(diào)整，調(diào)整后工藝為壓強(qiáng)250 MPa，保壓時(shí)間3.5 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)33%，該參數(shù)重復(fù)3次取平均值，得花青素提取量為36.15 mg/g，與預(yù)測(cè)值接近。模型能用于預(yù)測(cè)花青素提取量。

2.9 對(duì)比試驗(yàn)分析

將超高壓輔助提取法和傳統(tǒng)溶劑浸提法最優(yōu)工藝參數(shù)與最大提取量進(jìn)行對(duì)比。

超高壓提取與傳統(tǒng)溶劑提取花青素的對(duì)比見(jiàn)表5。

表5 超高壓提取與傳統(tǒng)溶劑提取花青素的對(duì)比

由表5可知，相較于傳統(tǒng)溶劑浸提法，超高壓輔助提取耗時(shí)少、操作簡(jiǎn)便，且花青素提取量提高了44.3%。綜合考慮實(shí)際操作、提取效果和成本，超高壓電場(chǎng)輔助提取法能高效提取藍(lán)靛果花青素。

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)確定藍(lán)靛果花青素超高壓提取工藝最佳參數(shù)為壓強(qiáng)260.5 MPa，保壓時(shí)間3.5 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)33.1%，花青素最大提取量為36.31 mg/g。與傳統(tǒng)溶劑浸提法相比，超高壓輔助提取顯著節(jié)省提取時(shí)間，節(jié)約了乙醇用量，花青素提取量提高了44.3%，是一種比較理想的天然產(chǎn)物提取方法。研究為超高壓技術(shù)在生物質(zhì)中有效成分的高效提取提供理論支持和借鑒參考。