馮俊博，程永波

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化一科，烏魯木齊 830000；*通訊作者,E-mail:chengyb2001@163.com)

放射治療是治療惡性腫瘤常用手段之一，但是在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生不良影響，醫(yī)學(xué)上稱為放射性血管損傷，血管內(nèi)皮細(xì)胞的纖維化是其主要的病理特征[1,2]?？梢钥隙ǖ氖牵赊D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β所介導(dǎo)的TGF-β-ALK5-Smad2/3信號(hào)通路與內(nèi)皮細(xì)胞的纖維化有著密切的聯(lián)系[3]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β1可作為誘導(dǎo)劑激活細(xì)胞內(nèi)的TGF-β-Smad2/3信號(hào)通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndoMT)的發(fā)生，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞纖維化[4-6]。但是就目前而言，對(duì)于該通路的上游靶點(diǎn)TGF-βⅠ型受體ALK5的相關(guān)研究較少，它作為一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，存在于細(xì)胞膜上。本研究提出假設(shè)，當(dāng)使用X射線輻照內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞膜上的ALK5被激活，從而誘導(dǎo)下游的Smad2/3發(fā)生磷酸化，調(diào)控整個(gè)纖維化的進(jìn)程。因此，研究輻照后內(nèi)皮細(xì)胞ALK5的表達(dá)變化以及使用RepSox(一種ALK5選擇性抑制劑)進(jìn)行干預(yù)，有助于我們深入地了解輻照后內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生纖維化與該信號(hào)通路的聯(lián)系，為防治放射性血管損傷提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 ECM培養(yǎng)基購自美國(guó)ScienceCell公司；CCK-8試劑盒購自中國(guó)Biosharp公司；RIPA裂解液購自中國(guó)Solarbio公司；PMSF蛋白酶抑制劑購自中國(guó)Solarbio公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國(guó)Thermo公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自中國(guó)Solarbio公司；ALK5、p-Smad2/3一級(jí)抗體購自英國(guó)Abcam公司；GAPDH一級(jí)抗體購自中國(guó)博奧森公司；二級(jí)抗體購自中國(guó)博奧森公司；熒光二級(jí)抗體Alexa Fluor 594購自中國(guó)中杉金橋公司；ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國(guó)Thermo公司；TB Green Premix Ex Taq購自日本Takara公司;RepSox購自美國(guó)MCE公司。

1.1.2 主要儀器 酶標(biāo)儀購自美國(guó)Bio-Rad公司；熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國(guó)Thermo公司；化學(xué)發(fā)光儀購自美國(guó)Bio-Rad公司；Varian cx直線加速器購自美國(guó)Varian公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與輻照 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞株HUVEC購自中國(guó)上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。將HUVECs分為對(duì)照組、輻照組(IR)和RepSox干預(yù)組(IR+RepSox)，使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM(含5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和1%雙抗)進(jìn)行培養(yǎng)，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，細(xì)胞密度80%傳代。輻照前24 h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并均勻鋪板。待細(xì)胞貼壁后，RepSox干預(yù)組加入濃度為1 μmol/L的RepSox，對(duì)照組和輻照組同時(shí)更換ECM培養(yǎng)基。干預(yù)24 h后使用Varian cx直線加速器X線(6 MV)照射輻照組和RepSox干預(yù)組，總劑量7 Gy。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于輻照后24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞均勻鋪至96孔板中，每孔細(xì)胞約3×103個(gè)。待細(xì)胞貼壁后，RepSox干預(yù)組分別加入濃度為1，5，10，20，40 μmol/L的RepSox 200 μl，對(duì)照組和輻照組加入等體積的ECM培養(yǎng)基。然后使用X線照射輻照組和RepSox干預(yù)組，于輻照后24,48 h向各組中加入CCK-8工作液20 μl，1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)量每個(gè)孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度(OD值)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)ALK5和p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平 將輻照后24 h的細(xì)胞用RIPA裂解液提取總蛋白；用BCA法測(cè)定蛋白濃度；進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育(一抗：ALK5 1 ∶1 000；p-Smad2/3 1 ∶1 000；GAPDH 1 ∶5 000；二抗：1 ∶5 000)和ECL試劑顯色。使用化學(xué)發(fā)光儀和Image Lab軟件分析條帶灰度值。

1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)ALK5蛋白表達(dá)水平 將細(xì)胞均勻鋪至共聚焦皿中，每個(gè)皿中細(xì)胞約3×104個(gè)。輻照后24 h加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，山羊血清工作液室溫封閉1 h，并加入一抗4 ℃孵育過夜(ALK5 1 ∶200)。次日二抗室溫孵育2 h(Alexa Fluor 594 1 ∶200)，使用DAPI試劑染色15 min。使用熒光顯微鏡成像和ImageJ圖像合成，ALK5表現(xiàn)為紅光，細(xì)胞核表現(xiàn)為藍(lán)光。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)ALK5、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)水平 輻照后24 h用Trizol提取mRNA，OD260/OD280為1.8-2.0；按試劑說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(基因引物序列見表1)；將合成的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。結(jié)果分析采用比較Ct法計(jì)算各樣本間基因表達(dá)差異，最終結(jié)果用2-ΔΔCt表示。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequence of target genes

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 輻照后細(xì)胞增殖情況

輻照后24 h和48 h，與對(duì)照組比較，輻照組細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)。與輻照組比較，1 μmol/L RepSox干預(yù)組細(xì)胞數(shù)量升高(P<0.05)，5,10,20,40 μmol/L RepSox干預(yù)組細(xì)胞數(shù)量降低(P<0.05)。故選擇RepSox濃度1 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(見圖1,2)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05；與輻照組比較,#P<0.05圖1 不同濃度RepSox干預(yù)下輻照后24 h內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況Figure 1 Proliferation of endothelial cells at 24 h after irradiation under different concentrations of RepSox

與對(duì)照組比較,*P<0.05；與輻照組比較,*P<0.05圖2 不同濃度RepSox干預(yù)下輻照后48 h內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況Figure 2 Proliferation of endothelial cells at 48 h after irradiation under different concentrations of RepSox

2.2 輻照后24 h蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，輻照組ALK5、p-Smad2/3蛋白表達(dá)量均上調(diào)(P<0.05)。與輻照組比較，RepSox干預(yù)組ALK5、p-Smad2/3蛋白表達(dá)量均下調(diào)(P<0.05，見圖3)。使用總劑量為7 Gy的X射線照射血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，輻照組ALK5蛋白表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)了113%;p-Smad2/3蛋白表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)了194%。在輻照前加入RepSox進(jìn)行干預(yù)，RepSox干預(yù)組ALK5蛋白的表達(dá)量較輻照組下調(diào)了35.6%；p-Smad2/3蛋白的表達(dá)量較輻照組下調(diào)了13.6%。

與對(duì)照組比較,*P<0.05；與輻照組比較,#P<0.05圖3 輻照后24 h內(nèi)皮細(xì)胞ALK5、p-Smad2/3蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of ALK5 and p-smad2/3 proteins in endothelial cells 24 h after irradiation

2.3 輻照后24 h mRNA表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，輻照組ALK5、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)量均上調(diào)(P<0.05)。與輻照組比較，RepSox干預(yù)組ALK5、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)量均下調(diào)(P<0.05，見圖4)。使用總劑量為7 Gy的X射線照射血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，輻照組ALK5 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)了56.2%;Smad2 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)了86%,Smad3 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)了79.5%。RepSox干預(yù)組ALK5 mRNA的表達(dá)量較輻照組下調(diào)了29.1%；Smad2 mRNA的表達(dá)量較輻照組下調(diào)了29.7%，Smad3 mRNA的表達(dá)量較輻照組下調(diào)了17.1%。

與對(duì)照組比較,*P<0.05；與輻照組比較,#P<0.05圖4 輻照后24 h內(nèi)皮細(xì)胞ALK5、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)Figure 4 The expression of ALK5，Smad2，Smad3 mRNA in endothelial cells 24 h after irradiation

2.4 輻照后24 h細(xì)胞免疫熒光

與對(duì)照組比較，輻照組ALK5蛋白表達(dá)上調(diào)。與輻照組比較，RepSox干預(yù)組ALK5蛋白表達(dá)下調(diào)(見圖5)。

圖5 輻照后24 h內(nèi)皮細(xì)胞ALK5熒光表達(dá)量Figure 5 The fluorescence expression of ALK5 in endothelial cells 24 h after irradiation

3 討論

放射性血管損傷是癌癥患者長(zhǎng)期放療的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，血管內(nèi)皮細(xì)胞在輻照后獲得持久的促凝劑和抗纖溶表型，進(jìn)而發(fā)生纖維化[1]。因此進(jìn)行輻照后內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生纖維化的分子機(jī)制研究，是防治放射性血管損傷的重要基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，使用總劑量為7 Gy的X射線照射血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，輻照組ALK5 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)了56.2%,ALK5蛋白表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)了113%;Smad2 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)了86%,Smad3 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)了79.5%，p-Smad2/3蛋白表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)了194%。通過上述結(jié)果表明，輻照可以激活內(nèi)皮細(xì)胞中的TGF-β-ALK5-Smad2/3信號(hào)通路。而ALK5作為纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)的功能性TGF-βⅠ型受體，調(diào)控著核心蛋白Smad3的磷酸化，是位于該信號(hào)通路上游的閥門，因此它的上調(diào)是輻照后內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生纖維化的重要基礎(chǔ)[7]。關(guān)于ALK5表達(dá)量上調(diào)的原因，本研究認(rèn)為TGF-β1的釋放與之密切相關(guān)。現(xiàn)已證實(shí)，當(dāng)潛在相關(guān)TGF-β1釋放肽(latency-associated peptide，LAP)和潛在TGF-β結(jié)合蛋白(latent TGF-β-blinding protein，LTBP)暴露于各種因素時(shí)，如強(qiáng)酸、ROS(活性氧)和血纖維蛋白溶酶等，將釋放出TGF-β1[8]。而輻照可能扮演著與上述暴露因素相似的角色，它促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1的釋放，后者作為誘導(dǎo)劑激活了TGF-β-Smad2/3信號(hào)通路。本研究從分子機(jī)制層面證實(shí)了輻照激活了內(nèi)皮細(xì)胞中的TGF-β-Smad2/3信號(hào)通路，是導(dǎo)致血管纖維化損傷的重要機(jī)制。

在輻照前加入RepSox進(jìn)行干預(yù)，RepSox干預(yù)組ALK5 mRNA的表達(dá)量較輻照組下調(diào)了29.1%，ALK5蛋白的表達(dá)量較輻照組下調(diào)了35.6%；Smad2 mRNA的表達(dá)量較輻照組下調(diào)了29.7%，Smad3 mRNA的表達(dá)量較輻照組下調(diào)了17.1%，p-Smad2/3蛋白的表達(dá)量較輻照組下調(diào)了13.6%。這一結(jié)果說明了RepSox對(duì)ALK5及其下游的Smad2/3有抑制作用，ALK5、p-Smad2/3的表達(dá)量均呈現(xiàn)下調(diào)。因此可以認(rèn)為RepSox對(duì)于輻照后所引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞的放射性損傷具有一定的保護(hù)作用。就目前而言，對(duì)于纖維化防治靶點(diǎn)這方面的研究是具有顯著意義的，因?yàn)閷?duì)于纖維化這一病理現(xiàn)象尚無明確統(tǒng)一的治療策略。在一些研究中證明，使用可溶性的TGFβRII蛋白片段和TGF-β中和抗體可以有效抑制TGF-β的促纖維化作用[9]。而對(duì)ALK5的探究，是對(duì)纖維化防治方案的一種重要補(bǔ)充，并提供了新的基因靶點(diǎn)和理論依據(jù)，為后續(xù)靶向治療的相關(guān)研究打下重要基礎(chǔ)。

在接下來的研究中，我們將測(cè)定輻照后TGF-β1的釋放量，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探求輻照后內(nèi)皮細(xì)胞和ALK5之間的聯(lián)系，進(jìn)一步深入了解ALK5在纖維化形成過程中的分子機(jī)制。同時(shí)將其下游的Smad2、Smad3、Smad7等基因和蛋白作為潛在的抑制靶點(diǎn)進(jìn)行研究，為防治放射性血管損傷提供新的基因靶點(diǎn)和理論依據(jù)。