羅 莎， 姜永杰， 趙麗梅， 張海濤， 張旭娟

（廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司，廣東湛江524000）

隨著我國(guó)漁業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖密度的增長(zhǎng)，養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過(guò)程中大量投喂人工配合飼料，養(yǎng)殖水體中飼料殘餌和排泄廢物等大量積累，致使養(yǎng)殖水體日益惡化，魚(yú)病爆發(fā)愈發(fā)頻密?？股卦谒a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的廣泛使用，對(duì)水生動(dòng)物疾病防治起到了十分積極的作用。但也造成了一系列嚴(yán)重的問(wèn)題，特別是耐藥性、藥殘、污染環(huán)境、食品安全等問(wèn)題引發(fā)社會(huì)各界的高度關(guān)注（Balcázar等，2006；Gatesoupe等1999）。由此，減少抗生素的使用，研發(fā)其替代品成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)（Rosalie等2001；Bruno等，2000）。益生菌是一類(lèi)對(duì)宿主有益的微生物，被作為一種新型的飼料添加劑，其能增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在腸道內(nèi)的消化吸收，調(diào)節(jié)宿主腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡，同時(shí)提高機(jī)體免疫與抗病能力（Otles等，2003）。水產(chǎn)上主要使用的益生菌菌種有芽孢桿菌屬、乳酸菌屬、弧菌屬和酵母等。其中芽孢桿菌具有耐高溫、耐酸堿等生物學(xué)優(yōu)點(diǎn)，滿足飼料加工特性，特別是可耐受膨化質(zhì)粒中調(diào)制的高溫高壓。2018年我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布的《飼料添加劑品種目錄》統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，可添加于飼料中的芽孢桿菌分別是枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和側(cè)孢芽孢桿菌（袁翠林等，2015）。已有研究表明，在水產(chǎn)飼料中添加芽孢桿菌，能夠抑制水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)有害微生物的快速繁殖生長(zhǎng)，促進(jìn)有益菌群的定植、生長(zhǎng)、繁殖，進(jìn)而維持機(jī)體腸道內(nèi)的菌群平衡，同時(shí)可以提高動(dòng)物的消化酶活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的目的（孔祎頔等，2019；王振華等，2018；蘇艷莉等，2016）。但目前研究菌種主要集中在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，而有關(guān)凝結(jié)芽孢桿菌在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究應(yīng)用則較少。因此，本研究以彭澤鯽（Carassius auratus var.Pengze）作為研究對(duì)象，在飼料中添加枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌 （Bacillus licheniformis）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）及地衣芽孢桿菌與凝結(jié)芽孢桿菌的混合菌，研究其對(duì)彭澤鯽生長(zhǎng)、背肌營(yíng)養(yǎng)成分、腸道結(jié)構(gòu)及消化酶活性的影響，為芽孢桿菌在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚(yú) 試驗(yàn)魚(yú)來(lái)自江蘇省高郵市卸甲鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶魚(yú)塘，試驗(yàn)開(kāi)始前暫養(yǎng)于鹽城恒興飼料有限公司試驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)飼料 以魚(yú)粉、豆粕、菜籽粕為蛋白原，共制作4種飼料，其中基礎(chǔ)飼料組作為對(duì)照組；其余4組分別在基礎(chǔ)飼料中添加1.5×108cfu/g的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌及復(fù)合菌（地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌=1：1），菌種由廣州市科沐生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)提供。采用逐級(jí)混勻的方式，混合均勻后，制粒成直徑2 mm的飼料，曬干后于陰涼干燥處保存，避免氧化?；A(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)） %

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，停食24 h，選取健壯整齊的初始體質(zhì)量為（25.04±0.21）g的彭澤鯽500尾，分成5組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25尾，以重復(fù)為單位放養(yǎng)于試驗(yàn)養(yǎng)殖水族箱中，分別飼喂對(duì)應(yīng)飼料。養(yǎng)殖周期為60 d。

1.4 飼養(yǎng)管理 流水飼養(yǎng)，每天水交換量約為2倍養(yǎng)殖水體積，水源為經(jīng)過(guò)過(guò)濾、曝氣充氧的地下井水。每天投喂相應(yīng)飼料兩次（8：30、16：00），飽食投喂，投喂前關(guān)閉充氣泵。每天監(jiān)測(cè)水溫、水流和充氣，記錄攝食量等。整個(gè)試驗(yàn)期間水溫控制22～25℃，pH 7.6～8.2，溶氧≧5 mg/L，氨氮＜0.05 mg/L。

1.5 樣本采集與測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束前24 h停止投喂，稱(chēng)量每水族箱試驗(yàn)魚(yú)總重。每水族箱隨機(jī)取15尾魚(yú)，尾靜脈采血，至于4℃冰箱12 h待血液凝固分層后，4℃離心機(jī)3500 r/min離心10 min，制備血清。取血后，于冰上解剖，分離肝胰臟和腸道用于測(cè)定消化酶活性。另取5尾魚(yú)，用生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物，根據(jù)腸道回折處，將腸道分為前腸、中腸、后腸三部分，前腸和中腸部分取1～2 cm，用福爾馬林固定，放置于4℃冰箱保存，用于制作組織切片。

1.5.1 飼料及肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 水分含量測(cè)定采用105℃恒溫烘干失重法 （GB 5009.3-2010）；粗蛋白質(zhì)測(cè)定采用凱氏定氮法（GB 5009.5-2010）；粗脂肪測(cè)定采用索氏抽提法（GB 5009.6-2010）；粗灰分測(cè)定采用馬福爐高溫灼燒法（GB 5009.4-2010）。

1.5.2 組織切片制作 常規(guī)法脫水，石蠟包埋后用冷凍切片機(jī)（Leica rm2245）連續(xù)切片，用伊紅和蘇木精依次染色，樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡（Olympus ix71）下觀察其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

1.5.3 組織消化酶活性的測(cè)定 用預(yù)冷的生理鹽水（4℃）清洗腸道，剔除脂肪、腸系膜，用濾紙吸干后，準(zhǔn)確稱(chēng)取腸道組織質(zhì)量，按質(zhì)量（g）：體積（mL）=1：9的比例，加入組織質(zhì)量9倍體積的生理鹽水，在冰水浴條件下進(jìn)行機(jī)械勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清，然后于4℃條件下保存待用。所有消化酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，若方差分析顯著，進(jìn)一步進(jìn)行Duncan’s比較，差異顯著水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌及復(fù)合菌對(duì)彭澤鯽生長(zhǎng)性能的影響不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽生長(zhǎng)性能的影響見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，飼料中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌及復(fù)合菌（地衣：凝結(jié)=1：1）后，彭澤鯽的增重率及特定生長(zhǎng)率均顯著升高（P＜0.05），且飼料系數(shù)顯著降低（P＜0.05）。其中復(fù)合菌組對(duì)彭澤鯽促生長(zhǎng)、降低餌料系數(shù)的表現(xiàn)最為突出，與對(duì)照組相比，末重增長(zhǎng)18.64%，增重率增長(zhǎng)46.79%，特定生長(zhǎng)率提高33.72%，飼料系數(shù)降低25%。同時(shí)飼料中添加各種芽孢桿菌后彭澤鯽形態(tài)指標(biāo)并無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

表2 不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽生長(zhǎng)性能的影響

2.2 飼料中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌及復(fù)合菌對(duì)彭澤鯽背肌營(yíng)養(yǎng)成分的影響 不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽背肌營(yíng)養(yǎng)成分的影響見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，在飼料中添加不同芽孢桿菌后對(duì)彭澤鯽背肌營(yíng)養(yǎng)組成并無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表3 不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽背肌營(yíng)養(yǎng)成分的影響 %

2.3 飼料中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌及復(fù)合菌對(duì)彭澤鯽腸道結(jié)構(gòu)的影響不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽前腸及中腸腸道結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)表4。飼料中添加芽孢桿菌后，彭澤鯽前腸和中腸腸道截面面積變大，褶皺數(shù)增多，肌層厚度加厚，但差異不顯著（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，飼料中添加地衣芽孢桿菌組彭澤鯽前腸絨毛高度顯著增高32.49%、中腸絨毛高度顯著增高48.81%（P＜0.05）；添加復(fù)合菌（地衣：凝結(jié)=1：1）組彭澤鯽前腸絨毛高度顯著增高38.18%、中腸絨毛高度顯著增高52.74%（P＜0.05）。

表4 不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽腸道結(jié)構(gòu)的影響

2.4 飼料中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌及復(fù)合菌對(duì)彭澤鯽消化酶活性的影響 不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽淀粉酶、胃蛋白酶及脂肪酶活性的影響見(jiàn)表5。與對(duì)照組相比，飼喂彭澤鯽含芽孢桿菌的飼料后，彭澤鯽血清、肝胰臟及腸道各部分的淀粉酶、胃蛋白酶及血清脂肪酶活性均升高。其中枯草芽孢桿菌組肝胰臟淀粉酶活性提高51.58%，血清脂肪酶活性提高41.68%（P＜0.05）；復(fù)合菌組血清和肝胰臟淀粉酶活性分別升高52.25%和50.97%（P＜0.05），血清脂肪酶活性升高46.16%（P＜0.05），但腸道各處淀粉酶活性與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。同時(shí)，淀粉酶與胃蛋白酶活性在腸道內(nèi)逐漸升高，后腸各消化酶活性最高。

表5 不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽消化酶活性的影響

3 討論

3.1 不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽生長(zhǎng)性能的影響芽孢桿菌具有分泌胞外酶的功能，在動(dòng)物攝食時(shí)，芽孢桿菌隨著飼料顆粒進(jìn)入動(dòng)物消化道后，會(huì)代謝產(chǎn)生大量抑制細(xì)菌繁殖生長(zhǎng)同時(shí)對(duì)宿主動(dòng)物無(wú)害的產(chǎn)物，如溶菌酶、超氧化物歧化酶等，除此之外，還能代謝產(chǎn)生各種有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、氨基酸、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及多種非淀粉多糖酶等（孔祎頔等，2019；王振華等，2018）。

在水產(chǎn)上，已有研究表明，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能有促進(jìn)作用。飼料中添加2 g/kg枯草芽孢桿菌，黑鯛的增重率顯著提高28.86%，特定生長(zhǎng)率顯著提高16.48%，胃、腸及肝臟的各種消化酶活力均有提高（李盈鋒等，2014）。在飼料中添加2×107cfu/g和2×108cfu/g枯草芽孢桿菌，可顯著提高團(tuán)頭魴的增重率及特定生長(zhǎng)率，從而提高團(tuán)頭魴的生長(zhǎng)性能（孫盛明等，2016），同時(shí)能顯著提高青魚(yú)的末體重并降低飼料系數(shù)（沈斌乾等，2013）。0.5%和1%的地衣芽孢桿菌可使鯉魚(yú)增重率提高14.35%和15.24%，同時(shí)使餌料系數(shù)降低73.2%和74.54%（劉陽(yáng)，2012）。飼料中添加0%～0.6%的地衣芽孢桿菌，（17.47±0.19）g的尖吻鱸的增重率和特定生長(zhǎng)率有逐漸升高的趨勢(shì)，且添加量為0.5%時(shí)增重率和特定生長(zhǎng)率均達(dá)到最大，比對(duì)照組分別提高9.77%和4.56%（李卓佳等，2011）。劉波等（2005）的研究結(jié)果也顯示，地衣芽孢桿菌能增加異育銀鯽的消化酶活性，促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)，提高飼料利用率，降低飼料系數(shù)。本試驗(yàn)與前人研究結(jié)果一致，在飼料中添加1.5×108cfu/g的枯草芽孢桿菌可以促進(jìn)彭澤鯽的生長(zhǎng)，降低飼料系數(shù)。

凝結(jié)芽孢桿菌是一種具有芽孢桿菌能產(chǎn)生孢子且穩(wěn)定存在，又具有乳酸菌可產(chǎn)生乳酸特性的革蘭氏陽(yáng)性菌（郭慶豐等，2018；張高娜等，2013）。在水產(chǎn)上有研究表明，在飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌能促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用（王振華等，2018）。付天璽等（2008）和袁豐華等（2010）分別發(fā)現(xiàn)，飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌后，能顯著提高奧尼羅非魚(yú)和尖吻鱸的生長(zhǎng)速度，降低飼料系數(shù)，提高飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率。飼料中凝結(jié)芽孢桿菌活菌含量為3.0×1011cfu/g時(shí)，奧尼羅非魚(yú)增重量提高8.56%，飼料系數(shù)降低8.18%（許國(guó)煥等，2008）。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在基礎(chǔ)飼料中添加芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，其中地衣芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌及其復(fù)合菌的促生長(zhǎng)作用更為顯著。這可能與菌種特異性有關(guān)，不同的菌種生理生化特性、代謝產(chǎn)物有一定的差異，這將導(dǎo)致在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌代謝物不同，引起的作用效果不同，且同種菌的不同菌株其生理特性也存在一定的差異，導(dǎo)致作用效果也不一定相同（張日俊，2005）。

3.2 不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽背肌營(yíng)養(yǎng)成分的影響 目前關(guān)于在飼料中添加芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物體營(yíng)養(yǎng)成分影響的研究得到的結(jié)論并不一致。在本試驗(yàn)中，彭澤鯽背肌營(yíng)養(yǎng)成分與飼料中是否添加芽孢桿菌無(wú)顯著關(guān)系。與沈斌乾等（2013）對(duì)青魚(yú)的研究結(jié)果相似，青魚(yú)的全魚(yú)營(yíng)養(yǎng)組成不受飼料中添加的枯草芽孢桿菌影響。同時(shí)與Merrifield等（2010）的研究結(jié)果，在攝食含枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌混合菌的飼料10周后，虹鱒的體成分與對(duì)照組相比無(wú)變化的結(jié)果相一致。但王彥波（2010）的研究表明，飼喂羅非魚(yú)含5×106～5×107cfu/g凝結(jié)芽孢桿菌的飼料8周后，其肌肉中粗脂肪水平顯著低于不添加組。虹鱒魚(yú)苗攝食含1.8×106～6.1×109cfu/g芽孢桿菌的飼料2個(gè)月后體脂肪隨飼料中芽孢桿菌添加量的上升而不斷下降，體蛋白和水分含量也受到一定程度的影響 （Bagheri等，2008）。這可能是因?yàn)轲B(yǎng)殖對(duì)象品種不同或試驗(yàn)期所處的生長(zhǎng)階段不同，飼料中添加的芽孢桿菌菌株和劑量不同，會(huì)造成芽孢桿菌對(duì)魚(yú)體成分影響的程度存在不同結(jié)果。

3.3 不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽腸道結(jié)構(gòu)的影響腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)和基本功能正常是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消化吸收的先決條件。已有研究表明芽孢桿菌有助于動(dòng)物腸道壁增厚、促進(jìn)腸黏膜生長(zhǎng)等，但在魚(yú)類(lèi)上鮮少報(bào)道。鯉魚(yú)攝食含芽孢桿菌的微生物添加劑后，前腸皺褶增多、呈乙形，且隱窩加深，腸上皮的微絨毛變粗、長(zhǎng)度更長(zhǎng)、數(shù)量增多，腸道上可與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)接觸的面積增大（張錦華，2003；劉克琳等，2000）。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果類(lèi)似，飼料中地衣芽孢桿菌和混合菌可顯著提高彭澤鯽前腸和中腸的絨毛高度，而單獨(dú)添加凝結(jié)芽孢桿菌，彭澤鯽腸道絨毛高度變化不顯著可能是由于本試驗(yàn)中芽孢桿菌添加計(jì)量限定，可在今后的試驗(yàn)中探究不同濃度芽孢桿菌對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道結(jié)構(gòu)的影響。

3.4 不同芽孢桿菌對(duì)彭澤鯽肌消化酶活性的影響 體內(nèi)消化酶活性的水平直接影響到魚(yú)類(lèi)對(duì)飼料的消化效率，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用程度，從而影響魚(yú)體的健康狀況和生長(zhǎng)速度。魚(yú)類(lèi)的消化酶主要有蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等。本研究中彭澤鯽后腸淀粉酶和胃蛋白酶活性最高。在鯉魚(yú)上也有類(lèi)似的研究結(jié)果，鯉魚(yú)的蛋白酶在消化道的后腸（后1/3段）活性最高;淀粉酶在整個(gè)消化道中均勻分泌，且其活性由前腸向后腸逐漸升高（白東清等，1999；倪壽文等，1992）；但倪壽文等（1993）亦有報(bào)道表明鯉魚(yú)消化道后1/3段蛋白酶活性最低。

芽孢桿菌能耐腸道的酸堿環(huán)境，芽孢進(jìn)入腸道后，除了能平衡腸道菌群外，還能產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)或多肽、維生素、氨基酸等（Gatesoupe，1999），還能產(chǎn)生較強(qiáng)的蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、纖維素酶等（Ghosh等，2002），而且這其中的許多酶是動(dòng)物體本身不能產(chǎn)生的，如植酸酶、果膠酶等。這些酶進(jìn)入動(dòng)物體消化道的“酶池”后，提高了消化酶活性，補(bǔ)充機(jī)體內(nèi)源酶的不足，促進(jìn)腸道黏膜皺襞增多，絨毛增長(zhǎng)密集，提高腸黏膜上皮細(xì)胞的吸收功能；同時(shí)還能維持并調(diào)節(jié)魚(yú)體腸道內(nèi)菌群的平衡，拮抗病原菌，降低降解膽酸的細(xì)菌數(shù)目，促進(jìn)機(jī)體對(duì)脂溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)（楊漢博，2002；余成瑤等，1996；王紅寧等，1994）。200～300 mg/kg地衣芽孢桿菌可使異育銀鯽食糜蛋白酶和淀粉酶活性及腸道組織蛋白酶活性升高（劉波等，2005）。攝食含1.0×1011cfu/kg凝結(jié)芽孢桿菌的飼料后，奧尼羅非魚(yú)的胃、腸道和肝胰臟蛋白酶活性顯著提高（付天璽等，2008）。本試驗(yàn)也表明，添加芽孢桿菌能提高肝胰臟、血清、腸道胃蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活性，其中添加枯草芽孢桿菌和混合菌（地衣芽孢桿菌與凝結(jié)芽孢桿菌）能顯著提高肝胰臟淀粉酶、中腸胃蛋白酶及血清脂肪酶活性，其他組差異不顯著可能與芽孢桿菌添加量有關(guān)。

微生態(tài)制劑可以提高魚(yú)類(lèi)腸道消化酶活性已被眾多試驗(yàn)研究所證實(shí)，但目前對(duì)其機(jī)理的研究甚少。魚(yú)體腸道消化酶活性的提高可能是由于飼料中添加的微生物刺激腸道或是由于長(zhǎng)期采食所添加的微生物引起腸的適應(yīng)性分泌而致；或攝入的有益菌分泌的酶能在魚(yú)體能發(fā)生作用，而使魚(yú)體腸內(nèi)蛋白酶、淀粉酶活力升高。關(guān)于微生態(tài)制劑提高魚(yú)類(lèi)消化酶活性的機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

在本試驗(yàn)條件下，飼料中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌均能促進(jìn)彭澤鯽生長(zhǎng)，提高消化酶活性，調(diào)節(jié)腸道健康；其中復(fù)合芽孢桿菌對(duì)腸道結(jié)構(gòu)及酶活性的影響效果最佳。但對(duì)于不同芽孢桿菌的最適添加量還有待進(jìn)一步研究。