李劍梅，郝 捷，池景良，張疏雨，柴林山，朱萬芹

（1．遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000；2．內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

蛹蟲草（Cordyceps militarys） 又名北冬蟲夏草，屬于真菌門（Fungi）子囊菌亞門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes） 肉座菌亞綱（Hypocreomyce－tidae） 肉座菌目 （Hypocreales） 蟲草科（Cordy－cipitaceae） 蟲草屬 （Cordyceps），是一種具有多種藥理功能的食（藥） 用菌[1－2]。研究表明，蛹蟲草子實體中含有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、麥角甾醇、氨基酸等多種生理活性物質，具有很高的藥用和保健價值，其中蟲草素（cordycepin） 即3’－脫氧腺苷（3’－deoxyadenosine），是首先從真菌中分離出來的核苷類抗菌素，在抑菌、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、降血脂、抗血小板凝集、改善記憶力等方面發(fā)揮作用。目前，已有不少以蟲草素為主要成分的藥品、保健品及化妝品研發(fā)成果，如蟲草素膠囊、用于治療動脈粥樣硬化及抗抑郁的藥物等，我國由蟲草素合成的治療白血病的新藥也已進入Ⅰ期臨床階段[3－6]。試驗依據(jù)蟲草素溶于水、熱乙醇的理化性質，采用回流水浴提取技術，在單因素試驗基礎上，采用響應面試驗方法優(yōu)化蛹蟲草子實體中蟲草素提取工藝，以提升蛹蟲草子實體中蟲草素提取效率，為蛹蟲草子實體中蟲草素充分提取及相關產(chǎn)品的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

蛹蟲草子實體，由遼寧省微生物科學研究院藥用蕈菌研究室提供，取1 kg蛹蟲草子實體于55℃鼓風干燥箱干燥至恒重，粉碎，過80目篩，備用。

蟲草素標準對照品（純度≥98%），索萊寶生物公司；乙腈，賽默飛世爾科技（中國） 有限公司；色譜純、無水乙醇為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設備

AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Waters2695型高效液相色譜儀，美國waters公司；色譜柱 Agilent ZORBAXEclipseXDB-Cl8（4.6 mm×250 mL TI，5 mm），安捷倫科技（中國） 有限公司；SL-H-4水浴鍋，江蘇榮華儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 蟲草素含量測定

1） 標準溶液

稱取蟲草素標準品10 mg，去離子水溶解，用流動相（乙腈5%、去離子水95%） 定容至100 mL，搖勻，配成濃度為100 μg·mL-1蟲草素標準品儲備液。準確吸取蟲草素儲備液0.25 mL、0.50 mL、1.25 mL、2.50 mL、5.00 mL、12.50 mL，置于 25 mL容量瓶中，用去離子水定容，稀釋成1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1、20.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1標準品溶液。

2） 樣品溶液

準確稱取蛹蟲草子實體粉末1.0 g，置于磨口三角瓶中，回流水浴提取，4 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，用去離子水定容至100 mL，搖勻；準確量取提取液5 mL，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

3） 色譜條件

色譜柱為 Agilent ZORBAXEclipseXDB-Cl8 （4．6 mm×250 mL TI，5 mm）；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：260 nm；柱溫：35℃；流動相：乙腈-水（乙腈5%、去離子水95%）；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。

1.3.2 單因素試驗

各因素固定值分別為10%乙醇提取、料液比1∶30、提取溫度80℃、提取時間2 h。保持其他3個因素不變，每次改變1個因素。各因素水平分別為：乙醇溶液體積分數(shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%；提取溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃；提取時間分別為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h；料液比 （g∶mL） 分別為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1∶40、1∶50、1∶60。采用外標法，利用高效液相色儀測定供試樣品液中蟲草素吸收峰面積，按照蟲草素標準曲線方程計算供測樣品液中蟲草素濃度，蟲草素得率（M，‰）公式為：

式中：C為供測樣品液中蟲草素濃度（μg·mL-1）；V為供測樣品液體積（mL）；M0為供測蛹蟲草子實體粉的質量（g）；f為供測樣品的稀釋倍數(shù)。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，以提取溫度（A）、提取時間（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、料液比（D） 為變量因素，以蟲草素得率為響應值，運用Design Expert 8.0.7軟件和BBD設計方案，建立4因素3水平的響應面分析試驗，并對回歸模型進行方差分析，確定最佳提取工藝。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜測定結果

各蟲草素標準品溶液進樣后，以峰面積為縱坐標，標準品質量濃度為橫坐標，進行線性回歸，其標準曲線見圖1。

圖1 HPLC法蟲草素標準曲線Fig.1 Standard curve of cordycepin

由圖1可得蟲草素的標準曲線方程為：Y=33 477X+13 493（R2=0.999 9）。其表明蟲草素在1.00 μg·mL-1～50.00 μg·mL-1的濃度內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系，其標準品色譜圖見圖2，供試品色譜圖見圖3。

由圖2、圖3可知，在規(guī)定的色譜條件下，供試樣品與蟲草素標準品溶液在相同的保留時間出現(xiàn)了蟲草素特征吸收峰，且樣品色譜峰分離效果良好。

圖2 蟲草素標準品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of cordycepin standard

圖3 供試樣品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of sample

2.2 單因素試驗結果

乙醇體積分數(shù)對蟲草素得率的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分數(shù)對蟲草素得率影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of cordycepin

由圖4可知，乙醇體積分數(shù)對蟲草素得率的影響較大，起初隨著乙醇體積分數(shù)的升高，蟲草素得率隨之升高，當濃度達到20%時，蟲草素得率最高（5.575‰），隨后呈下降趨勢?？赡苡捎谠谝欢ㄒ掖俭w積分數(shù)范圍內(nèi)，其可促進蟲草素的釋放，濃度過高會導致細胞膜上蛋白質迅速變性，反而不利于蟲草素的提取，同時隨著乙醇溶液體積分數(shù)的增大，脂溶性雜質的成分溶出量增加，可與乙醇、水分子結合，為蟲草素的競爭性抑制劑，導致蟲草素得率降低[7-8]。因此，最適提取溶劑為20%乙醇溶液。

2.2.2 提取時間對蟲草素得率的影響

提取時間對蟲草素得率的影響見圖5。

圖5 提取時間對蟲草素得率影響Fig.5 Effect of temperature on the yield of cordycepin

由圖5可知，在提取時間小于2 h時限內(nèi)，蟲草素得率隨著時間的延長呈快速增加趨勢，提取時間為2 h時，蟲草素得率快速達到較高水平（5.611‰），然后隨著提取時間的延長，蟲草素得率呈緩慢增加趨勢，提取時間為4 h時蟲草素得率達到極值（5.700‰），蟲草素得率與提取2 h時蟲草素得率相近，提高幅度較小，考慮到實際生產(chǎn)中能耗成本及提取工作效率，選擇蟲草素最佳提取時間為2 h。

2.2.3 不同提取溫度對蟲草素得率的影響

不同提取溫度對蟲草素得率的影響見圖6。

吊腳樓不僅憑借著大自然得天獨厚的條件和清秀古樸的造型使人眼前一亮；更因各族人民多少年來的辛勤堅韌以及聰明才智而兼具統(tǒng)一、均衡、對稱、幾何、線條、尺度、邏輯等簡潔、嚴謹有序的數(shù)學之美，使人心馳神往。

圖6 溫度對蟲草素濃度影響Fig.6 Effect of extraction time on the yield of cordycepin

由圖6可知，50℃～80℃時，蟲草素得率隨著提取溫度的升高而增加，80℃時得率達到最大值（5.781‰），后隨著溫度的升高蟲草素得率略有下降。原因可能是由于熱能的增加增大溶劑對物料的破壞力，進而促進了蟲草素的溶出速率，但隨著溫度的升高，其他物質的溶出速率增大，增加了溶液的粘稠度，影響了蟲草素提取效率。故蟲草素提取溫度選擇80℃較為合適。

2.2.4 不同料液比對蟲草素提取濃度的影響

不同料液比對蟲草素提取濃度的影響見圖7。

圖7 料液比對蟲草素濃度影響Fig.7 Effect of solid-to-solvent ratio on the yield of cordycepin

由圖7可知，不同料液比對蟲草素得率的影響較明顯，呈先增加后下降趨勢，其中料液比為1∶40時蟲草素得率最高（5.779‰）；后隨著液料比繼續(xù)增大，蟲草素得率隨之下降。因此，提取的液料比選擇1∶40較為合適。

2.3 響應面試驗結果與分析

2.3.1 響應面試驗結果與回歸方程擬合

結合單因素試驗結果，利用響應面 Box-Behnken模型試驗設計，選擇提取溫度（A）、提取時間（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、提取液料比（D）為自變量，以蟲草素得率為因變量，在4因素3水平上進行27個試驗點的優(yōu)化試驗，試驗因素與水平見表1，各因素編碼水平及結果見表2。

表1 響應面試驗因素與水平Tab.1 Design factors and level of response surface test

以表2蟲草素得率為響應值（Y），獲得的二次多元回歸方程為：Y=3.862+0.011A+0.217B+0.021C+0.051D+9.500×10-4AB+3.425×10-4AC+5.250×10-5AD-2.750×10-4BC+1.375×10-3BD-4.725×10-4CD-1.104×10-4A2-0.079B2-6.642×10-4C2-5.892×10-4D2。

表2 響應面試驗設計及結果Tab.2 Experimental design and results with response variables

2.3.2 模型方差及可信度分析

回歸方程模型方差分析結果見表3。

表3 回歸模型模型方差及可信度分析Tab.3 Analysis on variance and reliability of regression model

由表3可知，此模型達到極顯著水平（P<0.000 1），模型回歸顯著可靠，且失擬項P值為0.319 6（P>0.05） 不顯著，說明在試驗過程中未知因素對試驗結果影響較??；模型調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.936 6，表明在蟲草素回流水浴提取工藝中，約有93.66%的變異分布在所研究的4個因素中；相關系數(shù)R2=0.970 8，表明該方程較好的反應了蟲草素得率與提取溫度、提取時間、乙醇體積分數(shù)、料液比的關系，蟲草素得率的實際值與預測值之間具有較好的擬合相關性。因此，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

一次性顯著性檢驗，各因素對蟲草素得率的影響大小依次為：提取溫度>提取時間>乙醇體積分數(shù)>料液比；二次項中B2、C2、D2顯著性水平為極顯著（P<0.01），A2不顯著（P>0.05）；交互項中AC、CD的交互作用（P<0.01）對蟲草素得率的影響呈極顯著的正相關，AD、BC、BD交互項對蟲草素得率的的影響不顯著（P>0.05）。

2.3.3 響應面分析

響應面曲面坡度和等高線形狀能直觀反應各試驗因素及兩兩因素的交互作用對響應值蟲草素得率的影響，其統(tǒng)計結果見圖9、圖10。

圖9 因素CD和因素AC交互作用對蟲草素提取濃度影響的響應面圖及等高線Fig.9 Response surface diagram and contours of the interaction of parameters CD and AC on the extraction concentration of cordycepin

由圖9、圖10可以看出，各因素間的交互作用所形成的響應面均為開口向下的凸形曲面，蟲草素的得率由四周向內(nèi)逐漸增大，中心位置曲面最高處達到最大值，說明該模型具有極值。5種交互作用對蟲草素得率的影響程度不盡相同，相比而言，乙醇體積分數(shù)與料液比（CD）、溫度與乙醇體積分數(shù)（AC）、提取溫度與時間（AB）、提取溫度與料液比（AD）交互作用的響應面坡度陡峭，等高線呈典型的橢圓形及鞍形，對蟲草素提取濃度的影響顯著；提取時間與料液比（BD）、提取時間與乙醇體積分數(shù)（BC）交互作用的響應面坡度較陡，等高線為圓形，對蟲草素提取得率影響不顯著。

圖10 因素AB、AD、BD、BC交互作用對蟲草素提取濃度影響的響應面圖及等高線Fig.10 Response surface diagram and contours of the interaction of parameters AB,AD,BD,BC on the extraction concentration of cordycepin

通過分析及預測，獲得蟲草素最優(yōu)提取工藝條件及響應值的極值，即在提取溫度90℃、提取時間2.23 h、乙醇體積分數(shù)24.11%、料液比1∶40時，蟲草素得率最大預測值為5.922‰?？紤]到生產(chǎn)實際中可操作性，對技術參數(shù)進行了修正，確定優(yōu)化的提取工藝為：提取溫度90℃、提取時間2 h、乙醇體積分數(shù)25%、料液比1∶40。

2.3.4 優(yōu)化條件下的驗證試驗

為檢驗模型預測的準確性，在最佳提取條件下，進行3次平行提取驗證試驗，蟲草素得率分別為5.910‰、5.917‰、5.928‰，平均值為5.918‰，與理論預測值相近（5.922‰），誤差較小，表明優(yōu)化工藝合理、可靠，可以用來指導蛹蟲草子實體中蟲草素的提取。

3 結論

目前，蟲草素的提取方法主要有浸提法、回流水浴提取法、超聲波法、超臨界萃取等，其中回流提取方法相對于超聲提取、超臨界提取等常用提取方法具有操作簡單、溶劑用量少、設備成本低、穩(wěn)定性好和易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，且提取溶劑的乙醇可回收循環(huán)使用，在規(guī)模化生產(chǎn)中具有較高的實用價值[9-10]。試驗以回流水浴為提取方法，通過單因素試驗探索了影響蟲草素得率的主要因素，并應用響應面法進行了蛹蟲草子實體中蟲草素提取工藝參數(shù)的優(yōu)化，確定優(yōu)化的提取工藝為：提取溫度90℃、提取時間2 h、乙醇體積分數(shù)25%、料液比1∶40。在該工藝條件下，蛹蟲草子實體中蟲草素的得率與與理論預測值相近，工藝合理、可靠，為蛹蟲草子實體中蟲草素的高效提取及產(chǎn)品研發(fā)提供科學依據(jù)。