何亞磊，蔡葉銳，魏引，張金盈

1.云南省第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650011；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

缺血性心肌病是常見且危害較重的疾病之一，臨床多采用冠脈介入、溶栓及動(dòng)脈搭橋等治療，以恢復(fù)缺血區(qū)心肌的血液供應(yīng)，減少心肌梗死［1］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）時(shí)，心肌組織存在炎性浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞大量死亡及氧化應(yīng)激等，進(jìn)一步加重了心肌功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。因此，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者術(shù)后減少M(fèi)IRI對(duì)保護(hù)缺血心肌有重要的臨床意義［2］。研究顯示，減輕MIRI過(guò)程中的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)可有效緩解冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者術(shù)后心肌損傷。槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗高血壓及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［3］。研究顯示，槲皮素預(yù)處理可保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷［4］，可抑制糖尿病大鼠心肌炎癥小體的活性，降低炎癥水平，改善糖尿病性心肌損傷［5］。同時(shí)，槲皮素還可改善H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型中細(xì)胞的損傷及凋亡［6］，但未見其對(duì)MIRI大鼠模型的相關(guān)研究。因此，本研究擬建立大鼠MIRI模型，以期從核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（nuclear factor of kappa B，NF-κB）通路角度揭示槲皮素防治心肌梗死的作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物85只SPF級(jí)雄性SD大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量180～250 g，購(gòu)自北京維通利華生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2018-2-006。

1.2 藥物與試劑槲皮素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：C09S8Y53412）。白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（中國(guó)碧云天公司，批號(hào)分別為：20180413、20180309、20180506）；乳 酸 脫 氫 酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶同工酶MB（creatine Kinase-MB，CK-MB）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為：bsk00031、bsk00121、bsk00015）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、超微量ATP酶（Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP）試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：20180112、20180307）；兔抗鼠κB抑制蛋白激酶（inhibitor of nuclear factorκB kinase，IKK）、IκBα、NF-κB多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為：ab151543、ab6752、ab14356）。

1.3 儀器SH11/YF-9型光學(xué)顯微鏡（日本Olypmus公司）；Genios多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；ChemiDoc TM XRS+凝膠成像儀器（美國(guó)Bio-Rad公司）；RM6240型超聲心動(dòng)儀（日本Olypmus公司）。

2 方法

2.1 MIRI大鼠模型制備與分組將85只雄性大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組及槲皮素低、中、高劑量（25 mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1）組，每組17只，模型組及槲皮素各劑量組均建立MIRI模型。大鼠禁食不禁水12 h，給予10%烏拉坦麻醉，仰臥位固定，氣管連接呼吸機(jī)，標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)實(shí)測(cè)心電圖。75%乙醇左胸部消毒，剪開胸部，暴露心臟及表面血管，插入線栓造成心臟缺血30 min，剪開結(jié)扎線再灌注40 min建立MIRI模型［7-8］，其中假手術(shù)組僅分離前降支，不結(jié)扎。以收緊結(jié)扎線后大鼠的標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖ST-T段抬高，放松后抬高的ST-T下降1/2以上為MIRI模型建立成功。各組給予相應(yīng)的藥物，假手術(shù)組及模型組則給予同體積生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 測(cè)定大鼠心臟功能于末次給藥12 h后，采用超聲心動(dòng)儀檢測(cè)大鼠左心功能，記錄左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）和左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

2.2.2 觀察大鼠心臟病理學(xué)及心梗死面積百分比變化心臟功能測(cè)定完成后，每組隨機(jī)選3只大鼠，摘除心臟，用10%福爾馬林固定，蠟塊包埋后并切片，行HE染色，在光鏡下觀察病理學(xué)變化［9］。每組隨機(jī)選3只大鼠，取心臟，-20℃冷凍30 min后，行TTC染色，正常心肌組織呈紅色、梗死區(qū)呈灰白色。采用Image J軟件計(jì)算心肌組織梗死面積百分比。

2.2.3 檢測(cè)大鼠的心肌損傷指標(biāo)每組隨機(jī)選8只大鼠腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置20 min，2 000 r·min-1離心10 min后，檢測(cè)血清中LDH及CK-MB水平。

2.2.4 檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平檢測(cè)上述大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。

2.2.5 檢測(cè)心肌組織中SOD、MDA及Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP酶活力將取血后的8只大鼠，取心臟，制備10%心肌組織勻漿（心肌組織∶生理鹽水＝1∶9），4℃、4 000 r·min-1離心10 min，抽取組織上清液，測(cè)定MDA、SOD及超微量ATP酶（Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP）活力。

2.2.6 檢測(cè)大鼠心肌組織NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平每組隨機(jī)選取3只大鼠，取左心室心肌組織，剪碎后加入RIPA組織裂解液，裂解20 min，10 000 r·min-1離心20 min，取上清，測(cè)定蛋白濃度，并變性。取各組蛋白上樣，于12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，加入p-IκBα、p-IKK、p-NF-κB p65及IκBα、IKK、NF-κB p65和β-actin一抗（1∶1 000）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鼠抗兔二抗（1∶2 000），化學(xué)底物發(fā)光法顯色，圖像掃描分析。顯影的條帶采用Image-QuaNT軟件測(cè)量其灰度值，用目標(biāo)蛋白與β-actin灰度值的比值表示蛋白表達(dá)［10］。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素對(duì)MIRI模型大鼠心功能的影響與假手術(shù)組比較，模型組LVEF、LVFS均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素中、高劑量組LVEF、LVFS均顯著升高（P＜0.01），槲皮素低劑量組LVEF、LVFS均明顯升高（P＜0.05）。提示槲皮素可明顯增強(qiáng)MIRI大鼠的心肌收縮力，改善心臟功能。見表1。

表1 槲皮素對(duì)MIRI模型大鼠心功能的影響 （±s）

表1 槲皮素對(duì)MIRI模型大鼠心功能的影響 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

LVEF/% LVFS/%假手術(shù)組組別 n 17 88.42±4.41 58.76±4.81模型組 17 52.17±3.47** 33.29±3.19**槲皮素低劑量組17 58.28±4.41＃ 38.37±2.28＃槲皮素中劑量組17 67.67±3.89＃＃ 44.46±3.82＃＃槲皮素高劑量組17 79.29±4.47＃＃ 52.65±2.68＃＃

3.2 槲皮素對(duì)MIRI模型大鼠心臟病理學(xué)及心臟梗死面積百分比的影響假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊，無(wú)纖維斷裂及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)雜亂，存在心肌纖維斷裂及炎性浸潤(rùn)；槲皮素低、中、高劑量組大鼠心肌組織中炎癥細(xì)胞明顯減少，心肌損傷得到顯著緩解。見圖1。

圖1 槲皮素對(duì)MIRI模型大鼠心臟病理學(xué)的影響（HE）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟梗死面積百分比顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素中、高劑量組大鼠心臟梗死面積百分比均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），槲皮素低劑量組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。提示槲皮素可顯著改善MIRI大鼠造成的炎癥浸潤(rùn)及心肌梗死損傷。見表2、圖2。

圖2 槲皮素對(duì)MIRI模型大鼠心臟梗死面積百分比的影響（TTC）

表2 槲皮素對(duì)MIRI模型大鼠心臟梗死面積百分比的影響 （±s）

表2 槲皮素對(duì)MIRI模型大鼠心臟梗死面積百分比的影響 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

/%假手術(shù)組組別 n 心肌梗死面積百分比3.31±1.27模型組 3 48.26±5.47**槲皮素低劑量組 3 45.28±4.64槲皮素中劑量組 3 32.17±3.79＃槲皮素高劑量組 3 20.35±5.03 3＃＃

3.3 槲皮素對(duì)MIRI模型大鼠血清炎癥因子水平影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6水平均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素中、高劑量組大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；槲皮素低劑量組的IL-1β、IL-6水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），TNF-α水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s，ng·L-1）

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s，ng·L-1）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 n IL-6 IL-1β TNF-α 8 33.26±4.02 220.48±14.89 1.25±0.31模型組 8 76.64±6.58**401.86±42.64** 3.28±0.51*槲皮素低劑量組 8 68.18±3.46＃ 350.68±21.39＃＃ 3.18±0.28槲皮素中劑量組 8 55.48±4.42＃ 296.29±23.85＃＃ 2.39±0.42＃槲皮素高劑量組 8 40.21±3.67＃ 248.49±16.88＃＃ 1.68±0.34假手術(shù)組＃

3.4 槲皮素對(duì)MIRI大鼠心肌損傷標(biāo)志物及自由基氧化損傷標(biāo)志物的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中LDH及CK-MB水平均顯著升高（P＜0.01），心肌組織中SOD活性顯著降低（P＜0.01）、MDA水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素低、中、高劑量組大鼠血清中LDH、CK-MB水平顯著降低（P＜0.01），心肌組織中SOD活性顯著升高（P＜0.01）、MDA水平明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物及自由基氧化損傷標(biāo)志物的比較 （±s）

表4 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物及自由基氧化損傷標(biāo)志物的比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 n LDH/U·L-1 CK-MB/U·L-1 SOD/kU·g-1 MDA/mol·g-1±1.22模型組 8 417.81±56.73** 150.86±12.65** 79.65±9.26** 17.28±2.01**槲皮素低劑量組 8 320.51±32.81＃＃ 102.76±14.49＃＃ 90.71±7.96＃＃ 13.76±1.79＃槲皮素中劑量組 8 268.48±27.94＃＃ 78.97±8.71＃＃ 128.79±9.95＃＃ 9.96±1.36＃槲皮素高劑量組 8 189.72±31.75＃＃ 56.98±7.67＃＃ 150.66±11.21＃＃ 7.79±1.17假手術(shù)組 8 141.32±22.46 42.52±7.62 189.31±15.78 6.62＃＃

3.5 槲皮素對(duì)MIRI大鼠心肌超微量ATP酶活力的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素低、中、高劑量組Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力均明顯升高（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠心肌組織Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力的比較 （±s）

表5 各組大鼠心肌組織Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活力的比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n Na+-K+-ATP/U·mgprot-1 Ca2+-ATP/U·mgprot-1 8 8.44±1.69 0.26±0.02模型組 8 5.12±1.37* 0.11±0.01*槲皮素低劑量組 8 7.32±1.58＃ 0.31±0.04＃槲皮素中劑量組 8 10.24±2.79＃ 0.34±0.05＃槲皮素高劑量組 8 11.18±2.57＃ 0.46±0.07假手術(shù)組＃

3.6 槲皮素對(duì)MIRI大鼠心肌組織NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心 肌 組 織 中p-IκBα/IκBα、p-IKK/IKK及p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素各劑量組心肌組織中p-IκBα/IκBα、p-IKK/IKK及p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均顯著降低（P＜0.01）。見表6、圖3。

表6 各組大鼠心肌組織NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 （±s）

表6 各組大鼠心肌組織NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01

組別 n p-IKK/IKK p-IκBα/IκBα p-NF-κBp65/NF-κ Bp65假手術(shù)組3 0.34±0.01 0.16±0.02 0.12±0.01模型組 3 6.63±0.52**5.78±0.43** 6.02±0.49**槲皮素低劑量組 3 4.44±0.31＃＃3.66±0.34＃＃ 4.17±0.33＃＃槲皮素中劑量組 3 2.68±0.26＃＃2.28±0.17＃＃ 3.05±0.26＃＃槲皮素高劑量組 3 1.33±0.08＃＃0.97±0.04＃＃ 1.19±0.11＃＃

圖3 槲皮素對(duì)MIRI大鼠心肌組織NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)圖

4 討論

缺血性心肌病為近年來(lái)居民急性死亡的主要原因之一，其治療過(guò)程的缺血再灌注會(huì)進(jìn)一步加重心肌功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷［10］。槲皮素為黃酮類化合物，具有抗高血壓、抗氧化應(yīng)激損傷及改善內(nèi)皮功能等作用［3］。在構(gòu)建的H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型中，槲皮素能明顯降低缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞LDH及NO的釋放，減少心肌細(xì)胞損傷及凋亡［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可明顯增強(qiáng)MIRI大鼠的心肌收縮力，改善心臟功能，有效減輕心肌組織炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞水腫，改善心肌梗死面積百分比。提示槲皮素對(duì)MIRI模型大鼠具有明顯的保護(hù)作用，且隨著槲皮素劑量的增加，其保護(hù)作用愈加明顯。另有研究顯示，槲皮素還可減輕壓力超負(fù)荷大鼠左心室肥厚程度及心肌纖維化程度［12］。CK-MB和LDH為檢測(cè)心臟疾病的經(jīng)典生物標(biāo)志物，當(dāng)心肌細(xì)胞損傷時(shí)，心肌通透性增加，兩者由胞質(zhì)釋放到細(xì)胞外，因此兩者在血清中的濃度越高，心肌損傷越嚴(yán)重［13-14］。槲皮素干預(yù)后可明顯降低大鼠血清中CK-MB、LDH水平，這反映槲皮素可改善MIRI模型大鼠的心肌損傷。

研究表明，心肌MIRI與炎癥反應(yīng)、氧自由基的過(guò)量產(chǎn)生有密切關(guān)聯(lián)［15］。IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎因子，能促進(jìn)心肌組織炎性浸潤(rùn)，刺激其他炎癥因子表達(dá)，加劇心肌炎癥反應(yīng)［16-17］。研究表明，槲皮素對(duì)卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠支氣管哮喘具有明顯的抗炎作用［18］，對(duì)上述促炎癥因子同樣有顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可明顯降低MIRI模型大鼠血清中IL-6、IL-1β及TNF-α水平，提示槲皮素可顯著改善MIRI誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，且隨槲皮素劑量的增加其抗炎作用愈加明顯。

SOD是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)源性自由基清除酶，其在預(yù)防缺血再灌注期間氧化應(yīng)激損傷中有關(guān)鍵作用；MDA是氧自由基與細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化產(chǎn)物，其水平越高表示氧化損傷越嚴(yán)重，兩者均為評(píng)估心肌氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可使MIRI模型大鼠心肌組織中SOD活性升高，MDA水平顯著降低，表明其可通過(guò)清除氧自由基、增強(qiáng)心肌抗氧化酶活性來(lái)減少外周血中心肌酶含量，從而緩解MIRI造成的心肌組織損傷。

當(dāng)MIRI誘導(dǎo)心肌損傷時(shí)，可出現(xiàn)心肌細(xì)胞的過(guò)度收縮和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，出現(xiàn)線粒體鈣超載和細(xì)胞內(nèi)鈣超載，而Ca2+-ATP及Na+-K+-ATP兩種超微量ATP酶為維持心肌細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)，抑制兩種酶的活性可使Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣超載［21-23］。在本研究中，MIRI模型大鼠心肌組織Ca2+-ATP及Na+-K+-ATP酶活力降低，而槲皮素可顯著增加超微量ATP酶活力，使Ca2+外排，降低心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，避免心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而減少M(fèi)IRI誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

研究顯示，NF-κB p65蛋白及其抑制性蛋白IkBα在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。MIRI誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)除了能直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用外，還能作為信號(hào)分子調(diào)控某些相關(guān)基因的表達(dá)，其中NF-κB通路的活化是氧化應(yīng)激的主要作用靶點(diǎn)［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可顯著抑制p-IκBα、p-IKK及NF-κB p65水平，表明槲皮素可顯著抑制MIRI大鼠NF-κB通路的激活，從而減輕氧化應(yīng)激造成的心臟損傷。

綜上所述，槲皮素可顯著減輕MIRI引起的心肌損傷，改善心臟功能，抑制心肌組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)超微量ATP酶活力及抑制NF-κB通路有關(guān)。