高向陽,張芳

(1.鄭州科技學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，鄭州 450064；2.鄭州市食品安全快速檢測重點實驗室，鄭州 450064)

阿斯巴甜(C14H18N2O5)，白色結(jié)晶狀粉末，甜度約是蔗糖的200倍，在水中的最大溶解度為1%(25 ℃)。常溫下，在pH為3～5的弱酸性溶液中十分穩(wěn)定，高溫或高pH條件下會水解而導(dǎo)致甜味喪失[1-3]。阿力甜(C14H25N3O4S)，白色、無臭的結(jié)晶性粉末，甜度為蔗糖的2000倍以上，易溶于水。室溫下，阿力甜在弱酸溶液中半衰期為1～1.6年，在pH 5～8水溶液半衰期為5年[4-5]。阿斯巴甜和阿力甜廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中，對糖尿病人無影響，但若過量食用，可能會造成人體肝臟被破壞、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、致癌等[6-10]。

目前，食品中測定阿斯巴甜和阿力甜的方法有高效液相色譜法(HPLC)、超高效液相色譜法、反高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、離子色譜法(IC)等[11-26]，而且常用內(nèi)標法、外標法或歸一化法進行定量分析。這些測定方法操作繁雜，需測定空白溶液、繪制標準曲線或進行復(fù)雜計算，工作效率較低。

混標加樣法是一種新型分析技術(shù)，克服了上述分析方法的不足，只需取兩份同一標準液，一份不加試液，一份加一定體積的試液，混勻后在同一條件下進行測定。以相同保留時間下組分色譜峰信號是否有增加進行定性分析，以色譜峰信號值代入公式進行定量分析，無需繪制標準曲線和測定空白溶液，具有成本低、測定速度快、工作效率高、準確度高、適用范圍廣等突出優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可口可樂、菊花晶、酸奶、濃縮果汁、巧克力制品：市售，購于鄭州市二七區(qū)馬寨鎮(zhèn)好又多超市。

甲醇(色譜純)、乙醇(優(yōu)級純)、阿力甜標準品(C14H25N3O4S，CAS號：80863-62-3，含量為99.2%)：上海安譜實驗科技股份有限公司；阿斯巴甜標準品(C14H18N2O5，CAS號：22839-47-0，含量為95%)：BePune實驗科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

A100250多管渦旋混合儀 月旭科技股份有限公司；MS150/MS205DU電子天平(十萬分之一) 長沙市秋龍儀器設(shè)備有限公司；英國Dynamica V18R臺式冷凍離心機 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Utimate 3000 (2017LH131)高效液相色譜儀 賽默飛世爾科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準混合液的制備

乙醇-水(2+1)：取40 mL乙醇，用20 mL的水均勻混合。

80%-甲醇-水：取80 mL甲醇，用水定容到100 mL容量瓶中。

50%-甲醇-水：取50 mL甲醇，用水定容到100 mL容量瓶中。

阿斯巴甜和阿力甜標準儲備液的配制(0.50 mg/mL)：稱取阿斯巴甜0.02632 g(精確至0.0001 g)、阿力甜0.02520 g(精確至0.0001 g)，用水將阿斯巴甜和阿力甜分別溶解至50 mL容量瓶內(nèi)并定容至刻度，置于4 ℃左右的冰箱中保存，有效期為3個月。

阿斯巴甜和阿力甜混合標準工作液系列的配制：將阿斯巴甜和阿力甜標準儲備液用水逐級稀釋，等濃度等體積混合。

1.3.2 試液的制備和測定

分別制得20.00，10.00，5.00，2.50，1.00，0.50 μg/mL阿斯巴甜和阿力甜的混合標準溶液，置于4 ℃左右冰箱中保存，有效期為1個月。

1.3.2.1 碳酸飲料、固體飲料

稱取約5.0000 g(精確到0.001 g)碳酸飲料試樣于50 mL燒杯中，在超聲波振蕩器上除去二氧化碳，轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用水定容，備用。

稱取約1.0000 g(精確到0.001 g)固體飲料試樣于50 mL燒杯中，加10 mL水，超聲波振蕩提取20 min，移入25 mL容量瓶中；再向燒杯中加入10 mL水超聲波振蕩提取10 min，將兩次提取液移入同一個25 mL容量瓶中，用水定容，混勻，備用。

將上述容量瓶的液體分別在4000 r/min離心機上離心5 min，用0.45 μm的水系濾膜過濾上清液后作為待測試液，用于液相色譜分析。

1.3.2.2 酸奶、乳飲料

稱取5.0000 g(精確到0.001 g)酸奶于50 mL離心管中，加入10 mL乙醇沉淀酸奶中的蛋白質(zhì)，蓋緊蓋子；上下輕輕顛倒離心管5次(不能振搖)，將離心管混勻渦旋10 s后，靜置1 min，用4000 r/min離心機離心5 min，取上清液濾入25 mL容量瓶中，濾渣用8 mL 乙醇-水(2+1)洗滌后再離心，上清液移入同一個容量瓶中，用乙醇-水(2+1)定容至25 mL，混勻，用0.45 μm有機系濾膜過濾后得待測試液，用于液相色譜分析。

1.3.3 色譜條件

高效液相色譜儀：Utimate 3000(2017LH131)；色譜柱：Hypersil GOLD C18(150 mm×4.6 mm，SN：10567553)。流動相：甲醇∶水為40∶60；流速：0.8 mL/min；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：200.0 nm。

1.3.4 色譜分析方法

取兩份完全相同的混合標準液于離心管A和B中，離心管B中加入待測試液混勻。在同一色譜條件下，對離心管A中混合標準液進行色譜分析，得出阿斯巴甜的保留時間ts1及對應(yīng)的出峰信號hs1、阿力甜的保留時間ts2及對應(yīng)的出峰信號hs2；對離心管B中混合標準液進行色譜分析，得出阿斯巴甜的保留時間t1及對應(yīng)的出峰信號hs1+x1、阿力甜的保留時間t2及對應(yīng)的出峰信號hs2+x2。當ts1=t1，hs1+x1-hs1>0時，則待測食品中含有阿斯巴甜；當ts2=t2，hs2+x2-hs2>0時，則待測食品中含有阿力甜。

1.3.5 測定原理和公式

在一定條件下測定時，混合液的質(zhì)量與產(chǎn)生的測定信號在一定的范圍內(nèi)成正比，則有：

ms=ks×hs。

(1)

ms+mx=ks+x×hs+x。

(2)

在完全相同的條件下測定時，公式(1)、(2)中的k相同，因此，公式(1)除以公式(2)有：

因此，

(3)

(4)

式中：ms為阿斯巴甜或阿力甜在混合標準液中的質(zhì)量，hs為對應(yīng)于ms所產(chǎn)生的測定信號，mx為混合標準液加入待測試液，試液中阿斯巴甜或阿力甜的質(zhì)量，hs+x為對應(yīng)于(ms+mx)所產(chǎn)生的測定信號，m樣為待測試液中所含稱取樣品的質(zhì)量，w為阿斯巴甜或阿力甜在待測樣品中的質(zhì)量分數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 加樣法色譜圖比較分析

取兩個相同的離心管A和B，各加入1 μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合標準液45 μL，A管中不加待測試液，B管中加入100 μL可口可樂待測試液，均定容至1.00 mL，混勻后進行色譜分析。A管得到的液相色譜圖見圖1，B管的液相色譜圖見圖2。

圖1 阿斯巴甜和阿力甜混合標準液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of aspartame and alitame mixed standard solution

圖2 阿斯巴甜和阿力甜混合標準液加入可口可樂的色譜圖Fig.2 Chromatogram of aspartame and alitame mixed standard solution added with Coca-Cola

由圖1和圖2可知，阿斯巴甜和阿力甜在各自保留時間下，加入可口可樂后，各自的峰高均有增加。保留時間允許的誤差范圍內(nèi)ts1=t1，hs1+x1-hs1>0，則可口可樂中含有阿斯巴甜；ts2=t2，hs2+x2-hs2>0，則可口可樂中含有阿力甜，同理，可對其他樣品進行定性分析。

根據(jù)圖1可得，阿斯巴甜的保留時間ts1為3.640 min，峰高hs1為3.852 mAU；阿力甜的保留時間ts2為6.497 min，峰高hs2為2.654 mAU；根據(jù)圖2可得，阿斯巴甜的保留時間t1為3.640 min，峰高hs1+x1為9.925 mAU；阿力甜的保留時間t2為6.527 min，峰高hs2+x2為6.242 mAU。根據(jù)色譜圖的峰高，依據(jù)公式(3)、(4)可對樣品中的組分進行定量分析。

2.2 加樣法測定結(jié)果及精密度

表1 樣品的測定結(jié)果Table 1 The determination results of samples

續(xù) 表

由表1可知，5種試樣測定的RSD均小于5%。由色譜峰高值可簡便、快速計算出食品中待測組分的含量，也可用峰面積數(shù)據(jù)代入相應(yīng)公式計算。

2.3 樣品的檢出限和定量限

根據(jù)表1，按3倍標準偏差計算檢出限，按10倍標準偏差計算定量限。5種待測食品中阿斯巴甜和阿力甜的檢出限、定量限見表2。

表2 樣品的檢出限和定量限Table 2 The detection limits and quantitative limits of samples mg/kg

由GB 5009.263-2016《食品中阿斯巴甜和阿力甜的測定》的檢出限和定量限可知[27]，碳酸飲料、液態(tài)乳飲料中阿斯巴甜和阿力甜的檢出限為1.0 mg/kg，定量限為3.0 mg/kg；濃縮果汁中阿斯巴甜和阿力甜的檢出限為2.5 mg/kg，定量限為7.5 mg/kg；巧克力制品、水果及其制品、固體飲料及其制品中阿斯巴甜和阿力甜的檢出限為5.0 mg/kg，定量限為15.0 mg/kg。該方法的檢出限和定量限均低于國家食品安全標準中的檢出限和定量限。

2.4 加標回收率

以酸奶測定加標回收率，分別對樣品進行3個水平的加標回收，每個水平做6次平行測定，檢驗無可疑值后，取峰高平均值計算，見表3。

表3 樣品的加標回收率Table 3 The standard recovery rates of samples

由表3可知，酸奶中阿斯巴甜的回收率為90.3%～97.2%，阿力甜的回收率為91.0%～96.8%。由于各組分在色譜柱中得到了充分分離，互不干擾，該法尤其適用于多組分的色譜定性和定量分析，由各組分依次出現(xiàn)的色譜峰信號值，可快速計算各組分含量和回收率。

2.5 國標法對比實驗

2.5.1 國標法標準曲線的回歸方程

按國標法規(guī)定的波長和色譜條件，以50.00，45.00，40.00，35.00，30.00，25.00，20.00，10.00，5.00，2.50，1.00，0.50 μg/mL的標準混合使用液各進樣5 μL測定，以組分質(zhì)量濃度為橫坐標，以峰高為縱坐標繪制標準曲線，得出阿斯巴甜的回歸直線方程為Y=4.6921X-1.4649，阿力甜的回歸直線方程為Y=2.8836X-1.1944，相關(guān)系數(shù)r均為0.9999。

2.5.2 國標法測定結(jié)果

按國標法操作步驟，各樣品均進行6次平行測定，檢驗無可疑值后取平均值，見表4。

表4 國標法測定結(jié)果Table 4 The determination results of national standard method

由表4可知，國標法采用外標法繪制標準曲線并測定樣品中待測物質(zhì)的含量。結(jié)果表明：酸奶中阿斯巴甜和阿力甜含量最低，含量最高的為巧克力；阿斯巴甜的相對標準偏差為0.80%～4.8%，阿力甜的相對標準偏差為0.44%～3.8%。

2.6 顯著性檢驗

以酸奶為樣品，樣品前處理依據(jù)GB 5009.263-2016，用該法和國標法進行對照實驗，各樣品進行6次平行測定，結(jié)果見表5。

表5 對照測定結(jié)果Table 5 The comparison of determination results

由表5中數(shù)據(jù)和參考文獻[28]可知，計算出的F值小于F檢驗表中F0.05=5.05，表明混標加樣法與國標法之間不存在顯著的偶然誤差。計算出的t值小于t檢驗表中t0.05=2.23，表明混標加樣法與國標法間也不存在顯著的系統(tǒng)誤差，結(jié)論的置信度為95%。

3 結(jié)論

方法所用標準溶液、待測液和試劑量少，成本低，操作簡單，無需繪制標準曲線，無需測定空白和復(fù)雜計算，可快速獲得分析結(jié)果，實現(xiàn)了標準溶液和試液在同溶液背景、同體系、同方法、同儀器、同條件、同步操作下進行同時定性、定量分析，準確度得到保障和提升，有一定的創(chuàng)新性。由于各組分在色譜柱中得到了充分的分離，相互之間不干擾，尤其適用于色譜多組分的同時定性和定量分析。與國標法對照，用于測定食品中的阿斯巴甜和阿力甜，經(jīng)檢驗無顯著性差異。

該法不僅適用于液相色譜法，也適用于氣相色譜、離子色譜、超臨界流體色譜、毛細管電泳色譜法，以及化學(xué)發(fā)光、分子熒光、磷光分析法、生物發(fā)光分析法、原子發(fā)射光譜、原子吸收光譜、原子熒光光譜和紫外可見分子吸收光譜等諸多分析技術(shù)，不僅適用于阿斯巴甜和阿力甜的測定，也適用于其他物質(zhì)諸多組分的測定。根據(jù)所用方法不同，測定信號可以是色譜峰峰面積、色譜峰峰高、吸光度A、相對發(fā)光強度I等，方法的可行性和推廣應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛。