楊冬梅，王晨璐，劉嘉健，方越，葛瑛，韓淳致，曹榮月*

(1.中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 211198；2.澳門(mén)大學(xué) 國(guó)際中華醫(yī)藥研究院，澳門(mén) 00853)

糖尿病是一種嚴(yán)重的慢性病，過(guò)去幾十年中，隨著人們生活水平的不斷提升，糖尿病的病例數(shù)和患病率都在穩(wěn)步上升[1]。目前，糖尿病無(wú)法根治，患者的飲食控制對(duì)治療效果起著至關(guān)重要的作用。糖尿病患者需要避免攝入高糖、高脂、高蛋白的食物，尤其是糖類(lèi)食品對(duì)高血糖、肥胖癥患者有著強(qiáng)烈的升血糖作用，影響患者的治療效果[2]。糖類(lèi)物質(zhì)是引起甜味感覺(jué)的主要物質(zhì)[3]，隨著糖尿病患者的增加和低糖飲食人群數(shù)量的上升，為了滿足消費(fèi)者對(duì)甜味物質(zhì)的需求，研究人員把目光轉(zhuǎn)向非糖類(lèi)甜味劑。現(xiàn)今市場(chǎng)上的非糖類(lèi)甜味劑主要有3類(lèi)[4]，分別為人工合成非營(yíng)養(yǎng)型甜味劑、糖醇類(lèi)甜味劑、營(yíng)養(yǎng)性非糖甜味劑[5-6]。目前人工合成的非營(yíng)養(yǎng)型甜味劑作為常用食品添加劑被廣泛地應(yīng)用在各類(lèi)食品中，雖然人工合成甜味劑對(duì)人沒(méi)有直接的危害,但其安全性問(wèn)題尚無(wú)定論，而且過(guò)量使用可能會(huì)影響人體的代謝，對(duì)機(jī)體功能造成危害[7-9]。甜味蛋白作為一種新型營(yíng)養(yǎng)性非糖甜味劑，近些年的研究日漸廣泛。不同于攝入蔗糖等被分解為葡萄糖，甜味蛋白攝入后被分解為氨基酸，沒(méi)有直接且快速的升血糖作用，因此對(duì)于高血糖、易肥胖者具有重要的應(yīng)用意義。目前已有8種天然甜味蛋白被發(fā)現(xiàn)和研究，其中Monellin最初是從西非森林植物DioscoreophyllumcumminsiiDiels紅色漿果中分離提純得到的一種甜味蛋白[10]，天然Monellin由45個(gè)氨基酸殘基和50個(gè)氨基酸殘基的兩條多肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵連接在一起組成[11]。目前Monellin已經(jīng)被美國(guó)食品和藥物管理局 (FDA)批準(zhǔn)為“公認(rèn)安全”的食品添加劑。現(xiàn)有研究表明，按照不同的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，Monellin的相對(duì)甜度是蔗糖的800～2000倍不等，可用作甜味劑和增味劑[12]。與人造甜味劑相比，Monellin擁有一些重要的優(yōu)勢(shì)，它可以用作非碳水化合物甜味劑，開(kāi)發(fā)成為糖尿病患者的安慰性甜味劑或甜酵母片[13]，其安全性高并且不會(huì)將非天然代謝物引入人體，也不會(huì)干擾氨基酸庫(kù)的平衡，另外，Monellin蛋白基因相對(duì)容易克隆，可以引入到食品和飲料工業(yè)中使用的許多微生物中,具有巨大的市場(chǎng)潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種及質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)室保存的E.coliBL21(DE3)菌種，pET28Monellin質(zhì)粒：蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR清潔級(jí)雄鼠：揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2017-0007。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit、蛋白非預(yù)染MarkerⅡ、IPTG：生工生物工程(上海)股份有限公司；其他常見(jiàn)市售分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 儀器設(shè)備

HL-2恒流泵 上海滬西分析儀器有限公司；2000/2000c NanoDrop分光光度計(jì) Thermo Fisher Scientific公司；Beidi-1000E超聲波細(xì)胞破碎儀 南京貝帝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1E.coliBL21(DE3)電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備

在超凈工作臺(tái)中，將E.coliBL21(DE3)菌種的單克隆挑至滅過(guò)菌的LB試管中，活化8 h。按照1∶100的比例接種至20 mL LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜活化。按照1∶100的比例接種至500 mL LB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600值達(dá)到0.5時(shí)，迅速將菌液冰浴，并搖晃菌液使其快速冷卻。待菌液冷卻后，將菌液分裝至預(yù)冷的離心杯中離心20 min。倒掉上清液后，用 250 mL預(yù)冷的10%甘油溶液輕輕重懸，離心20 min。棄上清液，用10 mL 預(yù)冷的10%甘油溶液輕輕重懸，離心。于沉淀中加入1 mL預(yù)冷的GYT溶液輕輕重懸，混勻，測(cè)定波長(zhǎng)在600 nm處的OD值。用GYT溶液將剩余的細(xì)胞重懸至細(xì)胞濃度在2×1010～3×1010個(gè)細(xì)胞/mL。用1.5 mL EP管分裝，于-80 ℃保存。

1.2.2 重組子的轉(zhuǎn)化

將2 μL公司合成的重組產(chǎn)物加入制備的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，然后將其全部吸入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，插入電轉(zhuǎn)儀。電擊完成后，加入1 mL SOB培養(yǎng)基混勻，全部轉(zhuǎn)入新的1.5 mL EP管中，在37 ℃搖床中孵育 2 h。離心孵育后的菌液，吸去900 μL上清液，用200 μL微量移液器輕輕吹懸底部菌體，吸出20 μL擴(kuò)培到試管，其余的菌液均勻涂布到含有KNA抗性的平板上，倒置過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.3 陽(yáng)性克隆菌株的獲得

將陽(yáng)性單菌落用牙簽挑下至已滅菌的含有3 mL LB培養(yǎng)基的10 mL試管中，培養(yǎng)12 h后收集菌體，提取質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察核酸條帶位置，判斷轉(zhuǎn)化是否成功。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線

取活化后的菌種BL21(DE3)-pET28a Monellin按1∶100的比例接種于加有KNA的LB培養(yǎng)基錐形瓶中，于搖床培養(yǎng)24 h，以未接種菌體的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每隔一段時(shí)間測(cè)定培養(yǎng)基的OD600值，以光密度(OD600值)為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。根據(jù)生長(zhǎng)曲線確定加入誘導(dǎo)劑的時(shí)間。

1.2.5 乳糖誘導(dǎo)和IPTG誘導(dǎo)的濃度梯度與時(shí)間梯度對(duì)比實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行濃度梯度、時(shí)間梯度的乳糖誘導(dǎo)與IPTG誘導(dǎo)的探索實(shí)驗(yàn)，通過(guò)SDS-PAGE電泳的條帶，比較不同誘導(dǎo)條件下目的蛋白的表達(dá)效果，從而得出誘導(dǎo)的最佳條件。

1.2.5.1 菌種接種

取活化后的菌BL21(DE3)-pET28a Monellin(1∶100)接種于加KNA的LB培養(yǎng)基試管中，于搖床培養(yǎng)至OD600值約為0.6時(shí)加入誘導(dǎo)劑。

1.2.5.2 乳糖和IPTG最適誘導(dǎo)時(shí)間

取經(jīng)過(guò)搖床培養(yǎng)至OD600值為0.6的試管3支，3支均取樣記為0時(shí)樣品，其中一支試管不加入任何物質(zhì)，作為空白對(duì)照；一支試管中加入IPTG使其終濃度為0.9 mmol/L；向第三支試管中加入乳糖使其終濃度為8 g/L，繼續(xù)搖床培養(yǎng)，每間隔1 h取一次樣，空白組取培養(yǎng)終點(diǎn)樣，乳糖和IPTG每支試管均取8個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣。

1.2.5.3 乳糖和IPTG最適誘導(dǎo)濃度

取14支經(jīng)搖床培養(yǎng)至OD600值為0.6的試管，分為兩組，每組7支。向第一組各管中加入乳糖溶液使其終濃度分別為0，4，6，8，9，10，11 g/L，培養(yǎng)4 h后收集菌液。向另一組各管中加入IPTG溶液，使其終濃度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8，0.9，1.0 mmol/L，培養(yǎng)5 h后收集菌液，進(jìn)行全菌SDS-PAGE電泳，對(duì)條帶進(jìn)行分析，以獲得乳糖和IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度。

1.2.5.4 誘導(dǎo)劑的選擇

對(duì)乳糖最佳誘導(dǎo)濃度和IPTG最佳誘導(dǎo)濃度下的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以判斷目的蛋白在何種誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下表達(dá)量更高。

1.2.6 大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)

將BL21(DE3)-pET28a Monellin按照 1∶100 的比例接種到含有KNA抗性的 LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)其OD600值為0.6時(shí)加入IPTG母液使其終濃度為0.9 mmol/L，誘導(dǎo)5 h，通過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)。

1.2.7 甜味蛋白的提取純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液進(jìn)行低溫離心，隨后重懸菌體。于超聲波細(xì)胞破碎儀中破碎細(xì)胞，使蛋白游離出來(lái)。將超聲后的溶液離心10 min，收集上清液。取上清液與超聲沉淀分別制作蛋白電泳樣，確認(rèn)目的蛋白的存在形式。

1.2.8 鎳柱親和層析

利用Monellin蛋白帶有His標(biāo)簽采用鎳柱親和層析的方法對(duì)其進(jìn)行純化，依次上60，100，200，500 mmol/L咪唑洗脫液進(jìn)行梯度洗脫。流穿液、平衡液、洗脫液分別制樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過(guò)電泳結(jié)果判斷是否有未結(jié)合鎳柱的蛋白需要二次洗脫，以及蛋白被何種濃度的洗脫液洗脫下來(lái)，然后對(duì)含有大量蛋白的洗脫液進(jìn)行透析，透析液為去離子水。

1.2.9 甜味閾值的判定

本實(shí)驗(yàn)采用感官評(píng)定人員對(duì)甜味蛋白的稀釋溶液進(jìn)行雙盲感官評(píng)定的方式來(lái)檢測(cè)甜味蛋白的甜味。將透析得到的蛋白進(jìn)行凍干，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前將上述蛋白樣品濃度配制成10，25，50，75，100，125，150，175，200 μg/mL，對(duì)照蔗糖濃度為20 mg/mL。選擇20名身體健康、味覺(jué)正常的志愿者，男女各一半，年齡在20～40歲之間。志愿者先品嘗作為對(duì)照的蔗糖溶液，再由低濃度到高濃度品嘗甜味蛋白溶液。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，志愿者不知溶液的濃度，每次含入2 mL的樣品溶液，大約20 s后吐出并用去離子水漱口，給出分值后間隔幾分鐘再進(jìn)行下一濃度的評(píng)估。將每個(gè)濃度所得分?jǐn)?shù)求平均值，將分?jǐn)?shù)最接近2.0的樣品濃度定為甜味閾值。選擇分?jǐn)?shù)最接近1.0的樣品濃度，對(duì)照蔗糖濃度與其比值即為相對(duì)甜度。

1.2.10 蔗糖和甜味蛋白對(duì)ICR小鼠血糖的影響

Raben等[14]及Fujita等[15]采用短期甜味刺激的方式研究人工甜味劑對(duì)機(jī)體能量的影響，得出人工甜味劑對(duì)機(jī)體葡萄糖代謝的無(wú)效性。由此推斷攝入甜味蛋白的小鼠血糖濃度低于攝入葡萄糖的小鼠，高于或近似于飲水組的小鼠血糖濃度。長(zhǎng)期暴露的甜味刺激實(shí)驗(yàn)中，非能量型人工甜味劑與能量型蔗糖一樣，低甜度能夠增加機(jī)體葡萄糖耐受性，高甜度反復(fù)刺激機(jī)體時(shí)則會(huì)降低機(jī)體血糖的耐受性[16]。

通過(guò)感官評(píng)價(jià)，25 μg/mL該人工合成的甜味蛋白甜度與對(duì)照組20 mg/mL蔗糖甜度相近。取25只RIO型健康正常生長(zhǎng)期小鼠，饑餓處理12 h后，隨機(jī)分成5組，測(cè)定最低血糖濃度，記為0時(shí)血糖濃度。以25，37.5，50 μg/mL Monellin溶液、去離子水和20 mg/mL蔗糖溶液對(duì)各組小鼠分別灌胃，檢測(cè)灌胃后0.5，1，1.5，2，3，4，5 h的血糖值，繪制血糖時(shí)間曲線，比較各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖和血糖時(shí)間曲線的曲線下面積(AUC)。

2 結(jié)果與討論

2.1 BL21(DE3)-pET28a Monellin菌種的獲得

圖1 質(zhì)粒圖譜及電泳結(jié)果Fig.1 The plasmid diagram and electrophoresis results注：A為pET28a-MNEI 質(zhì)粒圖譜；B為陽(yáng)性單菌落提取質(zhì)粒核酸電泳結(jié)果：M表示250 bp DNA Ladder；1表示提取的質(zhì)粒。

根據(jù)Monellin的核苷酸序列合成含有His標(biāo)簽的質(zhì)粒，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1。將KNA篩選呈陽(yáng)性的單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行核酸電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1中B。核酸電泳在5600 bp處有條帶，證明電轉(zhuǎn)化成功，獲得目的菌種BL21(DE3)-pET28a Monellin，保存獲得菌種。

2.2 生長(zhǎng)曲線

重組菌的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2，取其OD600值為0.6時(shí)加入誘導(dǎo)劑，即其經(jīng)搖床培養(yǎng)5 h后加入誘導(dǎo)劑。

圖2 重組BL21(DE3)-pET28a Monellin菌的生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of recombination BL21(DE3)-pET28a Monellin strains

2.3 乳糖和IPTG最適誘導(dǎo)時(shí)間

圖3 乳糖和IPTG最適誘導(dǎo)時(shí)間的確定Fig.3 Determination of the optimal induction time of lactose and IPTG注：A表示IPTG誘導(dǎo)時(shí)間；B表示乳糖誘導(dǎo)時(shí)間；M表示蛋白非預(yù)染Marker Ⅱ，1～8分別表示誘導(dǎo)0，1，2，3，4，5，6，7 h。

由圖3可知，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)Monellin的表達(dá)量有明顯的影響，經(jīng)過(guò)Image J處理分析可知IPTG最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5 h，乳糖的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。

2.4 乳糖和IPTG最適誘導(dǎo)濃度

圖4 乳糖和IPTG最適誘導(dǎo)濃度的確定Fig.4 Determination of the optimal induction concentration of lactose and IPTG注：A表示IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Monellin；B表示乳糖誘導(dǎo)表達(dá)Monellin；M表示蛋白非預(yù)染Marker Ⅱ；IPTG濃度1～7分別表示0，0.2，0.4，0.6，0.8，0.9，1.0 mmol/L；乳糖濃度1～7分別表示0，4，6，8，9，10，11 g/L。

由圖4可知，對(duì)不同誘導(dǎo)物濃度的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)物濃度對(duì)Monellin的表達(dá)量有明顯的影響，經(jīng)過(guò)Image J處理分析可知IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.9 mmol/L，乳糖的最佳誘導(dǎo)濃度為10 g/L。

2.5 誘導(dǎo)劑的選擇

乳糖和IPTG都能誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)目的蛋白。以乳糖作為誘導(dǎo)物，誘使乳糖操縱子啟動(dòng)蛋白表達(dá)，但乳糖會(huì)被細(xì)胞分解利用，隨著誘導(dǎo)時(shí)間增長(zhǎng)，誘導(dǎo)效率會(huì)降低。IPTG憑借與乳糖相似的構(gòu)造，同樣能夠誘使蛋白表達(dá)啟動(dòng)，但細(xì)胞不分解IPTG，IPTG可以長(zhǎng)久而持續(xù)地發(fā)揮效用[17]。

圖5 誘導(dǎo)劑的選擇Fig.5 The selection of inducers注：M表示蛋白非預(yù)染Marker Ⅱ，1表示10 g/L乳糖誘導(dǎo)，2表示0.9 mmol/L IPTG誘導(dǎo)。

由圖5可知，對(duì)10 g/L乳糖誘導(dǎo)4 h和0.9 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)過(guò)Image J處理分析可知10 g/L乳糖誘導(dǎo)的Monellin表達(dá)量低于0.9 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的Monellin表達(dá)量，因此，相對(duì)于乳糖，選擇IPTG作為誘導(dǎo)劑。

2.6 Monellin在大腸桿菌中的表達(dá)形式

圖6 Monellin的表達(dá)形式Fig.6 Monellin's expression form注：M表示蛋白非預(yù)染Marker Ⅱ，1表示超聲上清，2表示IPTG誘導(dǎo)后全菌，3表示超聲沉淀。

由圖6可知，對(duì)誘導(dǎo)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)過(guò)圖像分析可知，Monellin主要存在于破碎細(xì)胞的上清液中，在沉淀中僅有少部分Monellin蛋白，故只需對(duì)上清液中的Monellin進(jìn)行純化處理。

2.7 鎳柱純化結(jié)果

圖7 Monellin的鎳柱純化結(jié)果Fig.7 Monellin's nickel column purification results注：M表示Marker，1表示60 mmol/L咪唑洗脫蛋白收集液，2表示100 mmol/L咪唑洗脫液，3表示200 mmol/L咪唑洗脫液，4表示500 mmol/L咪唑洗脫液，5表示蛋白收集液，6表示純化前沉淀，7表示純化前上清液。

由圖7可知，100，200 mmol/L咪唑洗脫下了目的蛋白，100 mmol/L咪唑洗脫下的蛋白含量明顯比200 mmol/L咪唑洗脫下的多。60 mmol/L咪唑洗脫下的蛋白大多是雜蛋白，500 mmol/L洗脫下的雜蛋白含量較低，無(wú)明顯條帶。因此，下一步透析對(duì)象即為100 mmol/L和200 mmol/L的咪唑洗脫液。

2.8 雙盲法評(píng)價(jià)甜味蛋白的甜度

選擇20位味覺(jué)正常的人口嘗甜味蛋白并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，他們一致認(rèn)為Monellin甜蛋白在最初幾秒不產(chǎn)生甜味覺(jué)，而后產(chǎn)生強(qiáng)烈甜味，但口感不如蔗糖，吐出后有干澀感。且濃度為25 μg/mL的甜味蛋白溶液甜度近似蔗糖對(duì)照溶液，即該甜味蛋白甜度等于800倍蔗糖甜度。100 μg/mL的蛋白濃度其分?jǐn)?shù)最接近2.0，視為甜味閾值。

表1 評(píng)價(jià)不同濃度Monellin甜度平均值Table 1 Evaluation of the average sweetness of various concentration of Monellin

2.9 蔗糖和甜味蛋白對(duì)小鼠血糖的影響

圖8 給予甜味蛋白、蔗糖、去離子水后小鼠血糖濃度變化Fig.8 Changes in blood glucose concentration in mice after giving sweet protein＇ sucrose and deionized water注：A表示去離子水、20 μg/mL蔗糖溶液、25 μg/mL Monellin溶液灌胃后血糖值變化曲線；20 mg/mL蔗糖溶液與25 mg/mL Monellin溶液血糖值比較，“**”表示p<0.01,“*”表示p<0.05；25，37.5，50 μg/mL Monellin溶液灌胃后血糖值變化曲線，各組間沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。

由圖8中A可知，給予蔗糖后小鼠血糖總體水平明顯高于給予去離子水組，給予Monellin后小鼠血糖水平高于去離子水組小鼠血糖水平明顯低于蔗糖組小鼠血糖水平。

由圖8中B可知，對(duì)3組小鼠分別給予25，37.5，50 μg/mL Monellin灌胃后，小鼠血糖水平?jīng)]有顯著性差異，即在一定范圍內(nèi)，小鼠血糖水平不受Monellin濃度變化的影響。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)由已知的具有Monellin相關(guān)基因的大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)甜味蛋白Monellin。通過(guò)光電比濁計(jì)數(shù)法測(cè)得實(shí)驗(yàn)條件下工程菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在其OD600值約為0.6，即培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)約為5 h后加入誘導(dǎo)劑。通過(guò)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)與乳糖誘導(dǎo)表達(dá)Monellin，并設(shè)置取樣時(shí)間，通過(guò)SDS-PAGE比較蛋白的表達(dá)量，從而測(cè)得實(shí)驗(yàn)條件下乳糖誘導(dǎo)該工程菌的最佳濃度是終濃度10 g/L，最佳時(shí)長(zhǎng)是4 h，IPTG誘導(dǎo)該工程菌的最佳濃度是終濃度0.9 mmol/L，最佳誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)是5 h。對(duì)兩種不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳比較后發(fā)現(xiàn)，IPTG的誘導(dǎo)效果更好。所以最終采用0.9 mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑大規(guī)模誘導(dǎo)BL21(DE3)-pET28a Monellin菌種，表達(dá)Monellin后親和層析提純蛋白，將純化后的Monellin凍干后稀釋?zhuān)M(jìn)行雙盲實(shí)驗(yàn)，以重量計(jì)，該重組Monellin蛋白甜度相當(dāng)于800倍的蔗糖甜度，其甜味閾值為100 μg/mL。向各組小鼠分別灌入25，37.5，50 μg/mL Monellin溶液、去離子水、20 mg/mL蔗糖溶液，與蔗糖相比，Monellin沒(méi)有顯著升高血糖的作用，并且在一定范圍內(nèi)，Monellin對(duì)血糖的影響不隨其濃度的改變而發(fā)生變化。

4 展望

天然甜味蛋白與基因工程以及蛋白質(zhì)工程的聯(lián)系日益密切，有關(guān)研究也愈加成熟。甜味蛋白Monellin雖然具有甜度高、引發(fā)糖類(lèi)相關(guān)疾病的可能性小等優(yōu)點(diǎn)，但是由于其對(duì)熱敏感，在酸堿條件下容易變性，導(dǎo)致Monellin難以實(shí)際應(yīng)用于食品生產(chǎn)行業(yè)[18]。目前已經(jīng)有研究人員[19]通過(guò)基因工程技術(shù)培養(yǎng)出了Monellin的突變體E23A 和 C41A，它們的熱穩(wěn)定性強(qiáng)且甜味閾值較低，具有廣闊的商業(yè)化前景，為甜味蛋白Monellin的研究提供了新的思路與依據(jù)。隨著基因工程技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)甜味蛋白Monellin研究的深入，不同位點(diǎn)的氨基酸對(duì)甜味蛋白Monellin的影響將更加明朗，劉洋等[20]為了確認(rèn)影響Monellin甜度的關(guān)鍵殘基，將位于循環(huán)區(qū)的殘基進(jìn)行誘變分析后發(fā)現(xiàn)，連接天然Monellin兩條單鏈的親性環(huán)L23是甜味蛋白Monellin的一個(gè)甜度決定位點(diǎn)，為Monellin的分子設(shè)計(jì)提供了有效指導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)室接下來(lái)將找到更符合工業(yè)化生產(chǎn)需要的突變體蛋白，從而全面地發(fā)揮Monellin的價(jià)值，以滿足市場(chǎng)對(duì)其產(chǎn)量和穩(wěn)定性的需求。