彭鵬，楊書勝，向雨晨，文君，司淵 ，劉瑩,3

(湖北醫(yī)藥學院 1. 基礎醫(yī)學院； 2. 武當特色中藥研究湖北省重點實驗室；3. 胚胎干細胞湖北省重點實驗室，湖北 十堰 442000)

結直腸癌是全球范圍內的常見惡性腫瘤之一[1]。雖然手術切除、放療、化療一定程度可提高患者總生存率，但晚期結直腸癌患者5年生存率僅14%[2]。

自噬是真核生物體內維持細胞穩(wěn)態(tài)的一種關鍵的降解途徑[3]。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著“雙刃劍”的作用。一方面腫瘤細胞可以通過保護性自噬來應對環(huán)境或治療所誘導的應激狀態(tài)，為自身提供能量“渡過難關”[4]。另一方面，當細胞過度自噬時，會導致細胞的病理變化并引起非保護性自噬/自噬性死亡，起到抑制腫瘤的作用[5]。據(jù)報道，一些批準的和/或實驗性藥物在不同類型的腫瘤細胞中誘導非保護性自噬而抗腫瘤[6]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated kinase, AMPK)在維持真核細胞能量穩(wěn)態(tài)中起重要作用[7]，其通過Thr-172磷酸化而發(fā)生活化[8]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路是AMPK下游調控自噬的關鍵通路。AMPK能夠通過直接磷酸化而負調控mTOR活性，從而激活自噬發(fā)生[9]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK可以作為一種腫瘤抑制因子參與多種類型的腫瘤自噬調控[10]。

重樓是一種傳統(tǒng)的中藥材，是百合科植物重樓的干燥根莖[11]。它具有抗真菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種治療用途[12]。重樓皂苷A (Polyphyllin A, PPA, 圖1)是從重樓中提取的一種天然皂苷類成分。研究表明，PPA能夠在肺癌[13]、前列腺癌[14]、膠質瘤[15]等多種腫瘤中誘導自噬進而發(fā)揮抗腫瘤作用。但是它在結直腸癌中的作用尚不完全清楚，本研究旨在探討PPA對結直腸癌的抗腫瘤作用及其作用機制。

圖1 重樓皂苷A的化學結構

1 材料和方法

1.1 試劑

RKO和HRT18結直腸癌細胞系購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。PPA(純度為98%)購自上海源葉生物科技有限公司。將PPA溶解于二甲基亞砜中并于-20 ℃儲存。二甲基亞砜、MTT(美國Sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；兔抗人LC3單克隆抗體、兔抗人AMPK、p-AMPK (Thr-172)、兔抗人p-mTOR(Ser-2448)、mTOR均為美國CST公司產(chǎn)品；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、GAPDH 均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；一抗稀釋液(日本東洋紡公司)；顯影膠片(日本柯達公司)；pQCXIP-GFP-LC3質粒(美國Addgene公司)；DAPI、Triton X-100、4%多聚甲醛、ECL顯色液均為上海碧云天試劑公司產(chǎn)品；Lipofectamine?3000 (美國Thermo Fisher公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

RKO細胞和HRT18細胞于-80 ℃保存；實驗時，取出細胞，置于37 ℃水浴鍋中快速搖動復蘇；完全融化后轉移至含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM，并置于37 ℃，含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁達80%時，用含EDTA的胰酶消化傳代并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 MTT實驗檢測細胞活力

取“1.2”中處于對數(shù)生長期的RKO和HRT18細胞，PBS洗滌，換新鮮DMEM調整細胞密度至6.7×104個/mL，接種于96孔板，每孔加入90 μL細胞懸液，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用培養(yǎng)基將PPA稀釋為0、4、8、12、16、20、24 μmol/L，分別取10 μL加入RKO細胞中，每種濃度設4個復孔；另用培養(yǎng)基將PPA稀釋為0、10、20、30、40、50、60 μmol/L，分別取10 μL加入HRT18細胞中，每種濃度設4個復孔；孵育20 h；分別加入10 μL MTT (5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，避光孵育并充分振蕩均勻；全自動酶標儀檢測490 nm波長處光密度(D)值，并計算細胞活力。細胞活力(%)=(實驗組D值-空白組D值)/(對照孔D值-空白組D值)×100%。篩選合適濃度進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞分組及處理

取“1.2”中處于對數(shù)生長期的RKO細胞和HRT18細胞，以3×105個/孔接種于6孔板，DMEM中培養(yǎng)24 h。根據(jù)“1.3”中細胞活力檢測結果，RKO細胞用含不同濃度PPA (0、0.6、0.7、0.8 μmol/L)的DMEM處理24 h，HRT18細胞用含不同濃度PPA (0、1.4、1.6、1.8 μmol/L)的DMEM處理24 h；用于后續(xù)蛋白印跡法檢測相關蛋白表達。

1.5 集落形成實驗檢測結腸癌細胞克隆形成能力

取“1.2”中處于對數(shù)生長期的RKO和HRT18細胞，以1×103個/孔接種于6孔板中。常規(guī)培養(yǎng)2周后，棄培養(yǎng)基，4%甲醛固定10 min，棄除固定液，每孔加入1 mL 0.2%結晶紫染色10 min，洗滌后光鏡下計集落個數(shù)。

1.6 免疫印跡法檢測結直腸癌細胞中相關蛋白的表達

收集“1.4”細胞，用含1%PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解20 min；12 000 r/min，4 ℃離心10 min；取上清液，BCA法測定蛋白濃度；加入等體積SDS振蕩均勻，99 ℃裂解5 min；80 V經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白；300 mA恒流轉膜2 h，使蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉1 h；TBST洗膜3次；加入對應的一抗稀釋液(LC3-Ⅱ、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR為1 ∶1 000，GAPDH為1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜；TBST緩沖液洗膜5次；加入HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗(2.5%脫脂奶粉稀釋，稀釋比為1 ∶5 000)，室溫孵育2 h；TBST洗膜5次；通過ECL顯色液壓片顯影，得到的圖片用電腦掃描，并用Image J軟件進行灰度分析。

1.7 免疫熒光實驗檢測自噬體形成

取“1.2”中處于對數(shù)生長期的RKO和HRT18細胞，以2×105個/孔接種至預鋪載玻片的12孔板，DMEM中培養(yǎng)24 h。按照Lipofectamine?3000操作說明，每孔加500 ng pQCXIP-GFP-LC3質粒，轉染細胞6 h；加入PPA處理RKO細胞(0、0.6、0.7、0.8 μmol/L)和HRT18細胞(0、1.4、1.6、1.8 μmol/L)，孵育24 h；4%多聚甲醛室溫固定20 min；用含0.3% Triton X-100的PBS室溫通透15 min；DAPI染色10 min；通過熒光顯微鏡檢測GFP-LC3自噬體。

1.8 分子對接檢測PPA與AMPK的結合能力

AMPK的三維結構在蛋白質數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)中編號為4CFF。α亞基為綠色，β亞基為藍色，γ亞基為洋紅色，配體PPA為紅色。PPA的化學結構如圖1所示。所有的對接實驗運用AutoDock 4.2程序。在AutoDock 4.2計算程序中，采用0.375間隔的70×70×70點陣模塊。使用Lamarckian遺傳算法進行對接計算，算法如下：150的群體，最大值2 500萬次能源評估，最高次數(shù)2 000，交叉率0.8，突變率0.02，獨立對接運行50次。使用公差為2的均方根偏差將對接構象聚類，并根據(jù)結合自由能評估最終對接結構。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 PPA顯著抑制結直腸癌細胞活力

MTT檢測結果顯示，在RKO細胞和HRT18細胞中，與0 μmol/L組相比，PPA各濃度組細胞活力均顯著降低(P均<0.05)；由此說明，PPA抑制細胞活力。PPA在RKO細胞中處理24 h的IC50約為1.38 μmol/L，在HRT18細胞中約為2.89 μmol/L，據(jù)此篩選出0.6、0.7、0.8 μmol/L PPA用于RKO細胞后續(xù)實驗，篩選出1.4、1.6、1.8 μmol/L PPA用于HRT18細胞后續(xù)實驗。見圖2。

a: P<0.05；b: P<0.01，與0 μmol/L PPA組比較

2.2 PPA對結直腸癌細胞克隆形成能力的影響

結果顯示，與0 μmol/L組相比，RKO細胞中0.7、0.8 μmol/L PPA組細胞克隆數(shù)明顯減少(t=5.677、10.035，P均<0.05)；與0 μmol/L PPA組相比，HRT18細胞中1.6、1.8 μmol/L PPA 組細胞克隆數(shù)明顯減少(t=14.362、17.443，P均<0.01)。由此可見，PPA在一定濃度范圍內能夠顯著抑制RKO和HRT18細胞的克隆形成能力。見圖3。

a:P<0.05；b: P<0.01，與0 μmol/L PPA組比較

2.3 PPA誘導結直腸癌細胞自噬

通過檢測自噬標記物LC3脂化形式(LC3-Ⅱ)的表達變化可以初步確定細胞自噬[16]。免疫印跡結果顯示，與0 μmol/L PPA相比，RKO細胞中0.6、0.7、0.8 μmol/L PPA組中LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯增加(P<0.05或P<0.01)，HRT18細胞中1.4、1.6、1.8 μmol/L PPA組中LC3-Ⅱ蛋白表達明顯增加(P均<0.01)。由此可見，PPA能夠誘導RKO和HRT18細胞中LC3-Ⅱ表達增加(圖4)，表明PPA促進自噬發(fā)生。為進一步證明PPA促進結腸癌細胞自噬，將pQCXIP-GFP-LC3質粒瞬時轉染到RKO細胞和HRT18細胞中，結果顯示，與對照組相比，PPA組細胞顯示出綠色熒光斑點化聚集，表明LC3在結腸癌細胞中發(fā)生重新分布(圖5)。由此表明，PPA誘導結直腸癌細胞發(fā)生自噬。

a:P<0.05；b: P<0.01，與0 μmol/L PPA組比較

圖5 免疫熒光檢測自噬體分布狀態(tài)(標尺=15 μm)

2.4 PPA激活結直腸癌細胞中自噬上游AMPK通路

免疫印跡結果顯示，與0 μmol/L PPA相比，RKO細胞中0.6、0.7、0.8 μmol/L PPA組中p-AMPK表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，在0.7、0.8 μmol/L PPA組中，p-mTOR表達水平顯著降低(P均<0.05)；與0 μmol/L PPA組相比，HRT18細胞中1.4、1.6、1.8 μmol/L PPA 組中p-AMPK表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，在1.6、1.8 μmol/L PPA組中p-mTOR表達水平顯著降低(P均<0.05)。由此可見，在一定濃度范圍內，PPA可能通過促進結直腸癌細胞中AMPK活化，進而抑制其下游的重要信號分子mTOR活化。見圖6。

2.5 PPA與AMPK具有結合作用

為進一步明確PPA對AMPK的激活作用，利用AutoDock 4將PPA與AMPK的三維結構進行分子對接。AMPK的α，β亞基中含有變構藥物和代謝物結合位點，此位點主要由α亞基的催化激酶結構域和β亞基的碳水化合物結合調節(jié)模塊構成[17]。PPA能夠以-5.65 kcal/mol的鍵能與變構藥物和代謝物結合位點結合(圖7A)并且與結構域的多個氨基酸殘基相互作用，包括：Val-24，Lys-29，Asn- 48，Gln-50，Lys-51，Arg-83，Ser-108，His-109，Asn-111和Ser-138(圖7B)。值得注意的是，PPA上的羥基與Lys-29、Ser-108和Asn-111形成穩(wěn)定結合的氫鍵，鍵長分別為2.7 ?、2.1 ?、3.0 ?。由此表明，PPA可以直接與AMPK結合。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，多種天然藥物如紫草素[18]、苦參堿[19]等可通過激活自噬而抑制多種腫瘤生長。本研究通過MTT實驗、克隆形成實驗初步證明PPA能夠抑制結直腸癌細胞增殖。LC3-Ⅱ是自噬體形成的關鍵組分[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度PPA均能夠誘導結直腸癌細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達增加；且GFP-LC3自噬體綠色熒光隨PPA濃度增加，由彌散狀態(tài)向斑點化聚集，由此表明PPA能夠促進結直腸癌細胞自噬。而PPA對結直腸癌的抑制作用是完全還是部分通過誘導自噬途徑完成，尚待進一步探討。

能量代謝的關鍵調節(jié)分子AMPK亦是自噬調控的關鍵激活因子[20]。AMPK可通過直接激活ULK促進自噬活化，亦可通過抑制mTORC1通路而激活自噬[21]。研究發(fā)現(xiàn)，臨床常用藥物二甲雙胍[22]、小檗堿[23]等可通過活化AMPK而誘導多種腫瘤細胞自噬性死亡。本研究選用不同濃度PPA處理結直腸癌RKO和HRT18細胞株，除0.6 μmol/L PPA處理的RKO細胞與1.4 μmol/L PPA處理的HRT18細胞中p-mTOR蛋白表達水平較對照組降低無統(tǒng)計學意義外，其他濃度PPA可顯著上調中p-AMPK水平，并抑制mTOR活性，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。由此推測，PPA可能通過AMPK/mTOR信號而誘導結直腸癌細胞發(fā)生自噬。進一步在分子對接模型中發(fā)現(xiàn)，AMPK的變構藥物與代謝物的結合位點是PPA的首選結合位點。以往研究表明，幾種AMPK激活劑，如A-769662[24]、水楊酸鹽[25]和Compound-991[26]等可以直接與變構藥物和代謝物的結合位點結合，并在腫瘤治療中表現(xiàn)出較好的效果；它們可通過抑制Thr-172去磷酸化來直接活化AMPKα，也可以通過維持β亞基的構象來間接激活AMPKα。本研究發(fā)現(xiàn)，PPA與變構藥物和代謝物的結合位點的多個氨基酸殘基發(fā)生相互作用，包括：Val-24，Lys-29，Asn- 48，Gln-50，Lys-51，Arg-83，Ser-108，His-109，Asn-111和Ser-138。最重要的是，PPA上的羥基與Lys-29、Ser-108和Asn-111形成3個鍵長分別為2.7 ?、2.1?、3.0 ?的穩(wěn)定結合的氫鍵。Ser-108是β亞基自身磷酸化的位點，該位點的磷酸化有利于維持變構藥物和代謝物的結合位點的穩(wěn)定性和配體結合親和力，從而維持AMPK α亞基Thr-172磷酸化，持續(xù)激活AMPK。總之，PPA與變構藥物和代謝物的結合位點可以形成相對穩(wěn)定的結合關系而直接激活AMPK。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)天然化合物PPA能夠直接與AMPK的變構藥物和代謝物的結合位點結合而激活AMPK，從而誘導結直腸癌細胞自噬。