劉雨辰，陸文江，陳 楚，史嘉玉，蘇憶玲，陸 齊

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，南通 226001)

心房顫動(簡稱房顫)是臨床上最常見的心律失常的一種類型，是心血管相關(guān)領(lǐng)域的兩大堡壘性疾病之一，因其會造成較高的致殘率和死亡率而備受關(guān)注。房顫會導(dǎo)致許多嚴(yán)重的并發(fā)癥，如心力衰竭、血栓栓塞、腦卒中、心原性休克等，尤其是腦卒中發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)要比一般人高5 倍。近年來導(dǎo)管消融治療在維持竇性心律和持續(xù)改善患者生活質(zhì)量等方面表現(xiàn)出色，越來越多的患者選擇其作為治療方案[1]。準(zhǔn)確的術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測成為選擇合適治療方案的關(guān)鍵。目前尚缺乏對其術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測的相關(guān)指標(biāo)。

免疫球蛋白(immunoglobulin G,IgG)是血清主要的抗體成分，糖基化是IgG 最常見的蛋白翻譯后修飾形式，IgG 糖基化的改變可以調(diào)節(jié)體內(nèi)各種炎癥反應(yīng)并影響多種炎癥相關(guān)疾病的進(jìn)展。IgG 聚糖構(gòu)象的微小變化與人類多種自身免疫性疾病相關(guān)，如癌癥[2]、糖尿病[3]、獲得性免疫缺陷綜合征[4]和卒中[5]等。因其聚糖具有可變性和對生理變化的先天敏感性等特質(zhì)，故可成為一種具有診斷性和預(yù)測性的生物標(biāo)志物。眾所周知，房顫也是一個炎癥反應(yīng)的過程，在房顫發(fā)生和持續(xù)時會釋放大量的炎癥因子[6-7]，故推測在房顫患者的血清中IgG 可能存在異常聚糖結(jié)構(gòu)的改變。

本研究量化了來自房顫患者及在年齡和性別匹配后的對照組患者的血漿IgG N-連接聚糖，并檢驗(yàn)了個體聚糖(GP1～GP24)的差異，旨在確定房顫潛在的糖類生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016 年9 月—2020 年3 月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科診斷為陣發(fā)性房顫并行環(huán)肺靜脈消融術(shù)患者192 例，術(shù)后常規(guī)服用胺碘酮及抗凝藥(華法令、利伐沙班、達(dá)比加群等)3 個月，具體治療方案由主治醫(yī)師決定。房顫診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2019年AHA/ACC/HRS 美國房顫管理指南：體表十二導(dǎo)聯(lián)心電圖或24 h 動態(tài)心電圖中對房顫的描述：(1)竇性P 波消失，出現(xiàn)無規(guī)律的心房波，f 波頻率在350～600 次/min；(2)出現(xiàn)無規(guī)律的QRS 波群，RR 間期絕對不齊。若患者滿足以上2 點(diǎn)，則診斷為房顫。陣發(fā)性房顫的定義則是持續(xù)時間≤7 d(?！?8 h)，能自行終止，反復(fù)發(fā)作。排除失訪及死亡患者31 例。納入的病例分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組。術(shù)后復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后3 個月后患者出現(xiàn)房顫、房撲、房速≥30 s，且被心電圖或動態(tài)心電圖證實(shí)。選擇同一時期行房顫消融術(shù)，術(shù)后未復(fù)發(fā)患者為對照組，均符合陣發(fā)性房顫標(biāo)準(zhǔn)，排除標(biāo)準(zhǔn)：患有免疫性疾病、確診惡性腫瘤、腎功能不全、糖尿病者。因糖基化具有雌激素及年齡依賴性[8-9]，因此排除<45 歲患者及未絕經(jīng)女性以減少誤差。本研究方案經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 隨訪數(shù)據(jù)收集 從術(shù)前開始入組隨訪，采用電話咨詢及門診復(fù)查心電圖進(jìn)行隨訪，隨訪時間為術(shù)后1、3、6、9、12 個月。房顫的診斷標(biāo)準(zhǔn)為患者的隨訪時心電圖或24 h 動態(tài)心電圖。

1.2.2 IgG 糖基化分析

1.2.2.1 血液的收集 所有調(diào)查對象于清晨空腹8～12 h，抽取靜脈血6 mL，血標(biāo)本編號與調(diào)查問卷上的研究序列號相對應(yīng)。全血標(biāo)本采集后1 h 內(nèi)離心(3 500 r/min,15 min)，吸出血清分裝置于-80 ℃冰箱，儲存至分析時間≤1 年。

1.2.2.2 IgG 的純化 采用96 孔Protein G 純化板[博格隆(上海)生物技術(shù)有限公司]親和層析的方法純化血清中的IgG。用4 倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液(20 mmol/L 磷酸鈉溶液,pH 9.0)平衡96 孔蛋白G純化板2 次，加入70 μL 血清與100 μL 結(jié)合緩沖液的混合溶液，室溫孵育45 min。離心去除過柱的廢液，再用5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗脫3 次去除未結(jié)合的蛋白。用2 倍柱體積的淋洗溶液(0.1 mol/L 甘氨酸溶液,pH 7.0)將IgG 洗脫到預(yù)先加入10 μL Tris-HCL 溶液的96 孔收集板中。采用BCA 試劑盒(Thermo fisher scientific 公司)檢測每個收集的樣品以確定收集液中IgG 的含量。

1.2.2.3 糖鏈的游離與純化 將糖苷酶(PNGaseF)(New England Biolabs 公司)工作溶液加入純化的IgG樣品溶液中，10 μL/孔，混勻后37 ℃過夜孵育。孵育結(jié)束后，將樣品加入到預(yù)先活化、平衡過的石墨化碳96 孔純化板(Grace 公司)孔中，反復(fù)上樣3 次后超純水洗2 次以去除鹽分與雜質(zhì)。然后用含0.05%(v/v)的三氟醋酸的25%(v/v)乙腈水溶液洗脫并收集糖鏈后真空濃縮至干。

1.2.2.4 糖鏈的熒光標(biāo)記 將20 mg 2-氨基苯甲酰胺完全溶解于400 μL 二甲基亞砜和冰乙酸的混合液(體積比7∶3)，然后將24 mg 氰基硼氫化鈉溶解于以上溶液，即為熒光標(biāo)記溶液。每份糖鏈加入3 μL標(biāo)記溶液后振蕩，60 ℃孵育2 h。孵育結(jié)束后，每份標(biāo)記液中加入50 μL 超純水混勻過0.22 μm 膜后待熒光標(biāo)記-超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)分析。

1.2.2.5 標(biāo)記糖鏈的UPLC 分析 標(biāo)記后的糖鏈樣品采用配有四元泵，熒光檢測器的Waters Acquity UPLC 進(jìn)行分離檢測。色譜參數(shù)為：超高效液相系統(tǒng)：Waters H-Class UPLC；色譜柱：ACQUITY UPLC○R BEH Amide 1.7 μm 2.1×100 mm Column；熒光檢測器：λex=330 nm，λem=420 nm；柱溫：60 ℃；自動進(jìn)樣器溫度：2～8 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動相：A，100 mmol/L 甲酸銨(pH 4.50±0.05)，B，100%乙腈；梯度見表1。數(shù)據(jù)處理采用傳統(tǒng)集成算法的自動處理方法并進(jìn)行手動校正。所有色譜圖都按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)分成24 組峰，每組峰百分含量=該峰面積/24 組峰總峰面積×100%。

表1 色譜梯度參數(shù)

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料均先行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的以中位數(shù)及四分位數(shù)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)；率之間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多變量Logistic 回歸分析確定24 種聚糖結(jié)構(gòu)與復(fù)發(fā)之間的相關(guān)性。危險(xiǎn)因素篩選采用逐步向前法。對每個聚糖結(jié)構(gòu)單獨(dú)進(jìn)行受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析，以驗(yàn)證其靈敏度和預(yù)測能力。所有的計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均采用雙尾P 值，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者的一般資料及GP1～GP24 比較 共192 例房顫患者符合入選標(biāo)準(zhǔn)，其中31 例患者因失訪等各種原因被排除，最終共計(jì)161 患者納入統(tǒng)計(jì)分析。其中復(fù)發(fā)患者81 例，未復(fù)發(fā)患者80 例，兩組患者的基線資料及GP1～GP24 比值比較見表2～3，色譜圖見圖1。

優(yōu)化結(jié)構(gòu)布局，改善設(shè)施條件：2020年末，全省農(nóng)村社會福利服務(wù)中心100%符合《養(yǎng)老機(jī)構(gòu)服務(wù)質(zhì)量基本規(guī)范》的基本要求，床位利用率達(dá)到70%以上，委托社會力量運(yùn)營管理的達(dá)到40%以上。

圖1 兩組患者的色譜圖

表2 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的基線資料比較(n,%,M,P25,P75)

表3 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的GP1～GP24 比較(M,P25,P75,)

表3 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的GP1～GP24 比較(M,P25,P75,)

2.2 聚糖單因素邏輯回歸分析 對GP1～GP24 進(jìn)行單因素分析，結(jié)果提示GP3b、GP4、GP5、GP6、GP8b、GP14、GP15、GP16a、GP16b、GP17、GP18a、GP18b、GP19、GP22、GP23 與房顫術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)(表4)。

表4 GP1～GP24 單因素邏輯分析

2.3 聚糖多因素邏輯回歸分析 通過多因素Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)誤及估計(jì)的OR 值太大，無法準(zhǔn)確顯示出屬于每個因素的真正的效應(yīng)量，因此對數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將納入Logistic 回歸模型的連續(xù)變量×1 000 作為數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，重新將基線資料中有意義的數(shù)據(jù)及轉(zhuǎn)化后的GP1～GP24 納入模型，危險(xiǎn)因素篩選采用逐步向前法。在24 個GP 中發(fā)現(xiàn)GP3a、GP6、GP14 和GP15 與房顫術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān)(表5)。

表5 多因素Logistic 回歸分析

2.4 各個聚糖的診斷效能分析 當(dāng)對在邏輯模型中發(fā)現(xiàn)重要的4 個聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行ROC 曲線分析時，發(fā)現(xiàn)GP3a、GP6、GP14 和GP15 的曲線下面積(area under curve,AUC)分別是0.579、0.648、0.916 和0.640，由此可看出GP14 具有良好的診斷效能(表6,圖2)。

表6 ROC 分析結(jié)果

圖2 ROC 分析曲線

3 討 論

近年來，隨著技術(shù)的進(jìn)步和新治療策略的發(fā)展，對于房顫的治療主要集中于復(fù)律及減少并發(fā)癥的發(fā)生，且對改善患者的遠(yuǎn)期生存質(zhì)量也提出了更高要求。因此，為了實(shí)現(xiàn)對房顫患者進(jìn)行有效的規(guī)范化治療，本研究嘗試尋找出可以預(yù)測房顫術(shù)后的生物標(biāo)志物用以幫助患者選擇合適的治療方案。本研究首次比較了房顫術(shù)后復(fù)發(fā)及未復(fù)發(fā)人群聚糖結(jié)構(gòu)的差異，探索了房顫復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，并且嘗試建立了房顫術(shù)后復(fù)發(fā)人群的聚糖譜。

本研究結(jié)果表明聚糖結(jié)構(gòu)GP3a、GP6、GP14 和GP15 有復(fù)發(fā)相關(guān)，從結(jié)構(gòu)上來看GP14 和GP15 都是半乳糖基化的聚糖，GP14 每增加0.001 單位時，房顫患者復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)為原有的0.787 倍。同時，GP15每增加0.001 單位時，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為原有的0.830 倍。研究[10]表明，在穩(wěn)定狀態(tài)下，25%～35%的血清IgG 聚糖均被半乳糖化，且炎癥的進(jìn)展與半乳糖部分?jǐn)?shù)量減少之間存在相關(guān)性，即當(dāng)IgG 聚糖缺失了2 個末端半乳糖時，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。IgG 的半乳糖基化也在抗炎活性中起到一定的作用[11]，當(dāng)IgG 抗體通過在Fc聚糖末端添加半乳糖，將IgG 抗體從促炎介質(zhì)轉(zhuǎn)化為抗炎介質(zhì)時，自身抗體炎癥可以得到抑制[12]。當(dāng)IgG 被半乳糖基化時，聚糖無法與FccRs 結(jié)合，C1q無法啟動抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用和補(bǔ)體的激活[13]。因此根據(jù)本研究結(jié)果，無半乳糖基化聚糖的指數(shù)增長可能有助于增強(qiáng)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)和補(bǔ)體活性的增強(qiáng)，同時也降低了IgG 的免疫抑制的潛能并使促炎活性增強(qiáng)。

另外，GP6、GP14、GP15 都是具有巖藻糖基團(tuán)的半乳糖基化聚糖，缺乏巖藻糖的Fc 和FccRⅢA，與自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC 之間的結(jié)合以及通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的病毒抑制的抗病毒活性均增加。所以，當(dāng)僅從聚糖的Fc 部分中去除1 個巖藻糖殘基時，在ADCC 啟動時IgG 的效力會增加50～100倍。小鼠體內(nèi)模型的研究[14]表明存在無巖藻糖基化IgG 時，ADCC 的效力會增加。這表明GP6、GP14、GP15 存在巖藻糖部分將有助于降低ADCC 活性，這也與本研究結(jié)果相吻合。

本研究通過回歸模型篩選出4 個重要的聚糖，對它們進(jìn)行了ROC 曲線分析，對這4 種聚糖結(jié)構(gòu)作為潛在生物標(biāo)志物的預(yù)測診斷能力和敏感性進(jìn)行評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GP14 在預(yù)測復(fù)發(fā)中敏感性最高，同時，GP14 在房顫復(fù)發(fā)患者的炎癥反應(yīng)中存在并以91.6%的預(yù)測準(zhǔn)確性可能成為潛在的診斷生物標(biāo)志物。

當(dāng)然，本研究也存在局限性。首先，回顧性研究可能影響數(shù)據(jù)的質(zhì)量和完整性，且在GP14 作為一個預(yù)測指標(biāo)應(yīng)用于臨床之前，需要通過大量準(zhǔn)確的前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)行廣泛的調(diào)查。其次，患者人群來自單一的三級轉(zhuǎn)診中心。因此，由于這種選擇和轉(zhuǎn)診偏移使得該患者隊(duì)列可能不代表一般的陣發(fā)性房顫人群。另外，本研究僅限于局部地區(qū)單中心的絕經(jīng)后老年女性及老年男性，在未來需擴(kuò)大研究樣本，將中青年患者都納入分組并且聯(lián)合多中心進(jìn)行研究，從而確定聚糖結(jié)構(gòu)的改變是否能適用于不同群體的房顫患者作為術(shù)前評價(jià)的新指標(biāo)。目前隨訪時間較短，在未來需對這類患者進(jìn)行長期隨訪，以探索聚糖結(jié)構(gòu)的改變與房顫患者是否會發(fā)生心衰住院、卒中、心肌梗死及器官出血等風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

綜上所述，聚糖結(jié)構(gòu)的改變與房顫術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，并且GP14 可能作為房顫復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)志物。