景 瑾，楊曉慧，劉 春*，顧小俠***

(1 南通大學(xué)杏林學(xué)院，南通 226200；2 南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；3 江蘇省南通市中醫(yī)院腫瘤科)

肺癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一[1]?？拱┧幬镌诜伟┲械闹委煴夭豢缮伲瑐鹘y(tǒng)抗癌藥物雖然應(yīng)用廣泛，但毒副作用、治療效果等問題仍然存在，因此研發(fā)新型抗肺癌藥物意義重大。在癌癥治療中，中醫(yī)中藥具有保護(hù)臟器、調(diào)節(jié)免疫功能、抑瘤抗癌、改善癥狀等作用[2]。濟(jì)生散是南通市中醫(yī)院腫瘤科經(jīng)過二十多年臨床研究，自創(chuàng)用于肺癌治療的藥方，臨床療效良好[3]。濟(jì)生散中的主要中藥成分有黃芪、沙參、太子參、蛇舌草、仙鶴草、莪術(shù)等。方中黃芪、沙參、太子參益氣養(yǎng)陰；仙鶴草補(bǔ)虛扶正治本；蛇舌草清熱解毒散瘤；莪術(shù)化淤治標(biāo)。其作用機(jī)制有必要深入研究。

本研究通過濟(jì)生散濃度梯度、時(shí)間梯度分別作用于人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)、人肺腺癌細(xì)胞(A549、H1975)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，檢測細(xì)胞增殖、周期和凋亡水平的變化，以期揭示中藥濟(jì)生散的抗癌作用機(jī)制，為濟(jì)生散的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 中藥濟(jì)生散 濟(jì)生散方由南通市中醫(yī)院中藥房提供，主要成分：黃芪30 g、沙參15 g、太子參15 g、蛇舌草30 g、仙鶴草30 g、莪術(shù)10 g，常規(guī)煎煮成含生藥2 g·mL-1，0.22 μm 濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆茫? 個(gè)月內(nèi)用完。

1.1.3 主要儀器及試劑 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo 公司；倒置相差顯微鏡、光學(xué)顯微鏡購自Leica 公司；抗生素、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、0.25%胰蛋白酶購自Gibco 公司；胎牛血清、DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自Hyclone 公司；培養(yǎng)瓶購自Corning 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit 8,CCK-8)試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代和凍存 BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；待細(xì)胞密度長至80%～90%后，細(xì)胞1∶3 傳代或凍存。

1.2.2 濟(jì)生散濃度梯度刺激BEAS-2B、A549、H1975細(xì)胞 待BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞長至80%時(shí)，胰酶消化，離心去上清，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔5 000 個(gè)細(xì)胞100 μL 接種于96 孔板。細(xì)胞培養(yǎng)過夜，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)為對(duì)照，以1、2、4、6、8、10、15、20 μL 濟(jì)生散分別刺激細(xì)胞24 h，空白對(duì)照組只加入培養(yǎng)基不加細(xì)胞，藥物對(duì)照組加培養(yǎng)基和10 μL 濟(jì)生散不加細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。在濟(jì)生散刺激0、24、48、72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，在酶標(biāo)儀A 450 nm 處測量各孔的吸光度值。

1.2.3 濟(jì)生散時(shí)間梯度刺激BEAS-2B、A549、H1975細(xì)胞 每孔5 000 個(gè)細(xì)胞100 μL 接種于96 孔板。細(xì)胞培養(yǎng)過夜，以PBS 為對(duì)照，2 μL 濟(jì)生散分別刺激細(xì)胞2、4、6、8、10、12、24 h 和不換液持續(xù)刺激?？瞻讓?duì)照組只加入培養(yǎng)基不加細(xì)胞，藥物對(duì)照組加培養(yǎng)基和2 μL 濟(jì)生散不加細(xì)胞，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。在濟(jì)生散刺激0、24、48、72 h后CCK-8 法測細(xì)胞活力。

1.2.4 A549、H1975 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，離心去上清，接種于6 孔板，細(xì)胞培養(yǎng)過夜，根據(jù)96 孔板和6 孔板的底面積以及培養(yǎng)基量換算選擇32 μL 濟(jì)生散濃度刺激A549、H1975 細(xì)胞8 h，以PBS 刺激為對(duì)照。培養(yǎng)24 h 細(xì)胞長至60%～70%時(shí)，棄完培，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞活力檢測 每孔5 000 個(gè)細(xì)胞100 μL 接種于96 孔板。細(xì)胞培養(yǎng)過夜，以PBS 為對(duì)照，2 μL 濟(jì)生散刺激細(xì)胞8 h，在濟(jì)生散刺激0、24、48、72 h 后CCK-8 法測BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞活力。

1.2.6 BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞周期檢測 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞傳代，貼壁，32 μL 濟(jì)生散刺激8 h后，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)照組長至80%左右，胰酶消化，收集細(xì)胞。70%乙醇4 ℃固定2 h，離心，PBS 洗細(xì)胞1次。每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL 碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液，37 ℃避光溫浴30 min。流式細(xì)胞儀檢測，每組細(xì)胞3 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次。

1.2.7 BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞凋亡檢測 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞傳代，貼壁，32 μL 濟(jì)生散刺激8 h后，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)照組長至80%左右，胰酶消化，收集細(xì)胞。用凋亡試劑盒中的緩沖液重懸細(xì)胞，然后依次加入兩種染液AV 和PI 各5 μL，并設(shè)3 個(gè)對(duì)照組，分別為空白單染PI、空白單染AV 及全空白組，室溫下避光反應(yīng)20 min，流式細(xì)胞儀檢測。右上象限為晚期凋亡細(xì)胞和右下象限為早期凋亡細(xì)胞，每組細(xì)胞3 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)均采用STATA 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，應(yīng)用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)分析軟件作圖。數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 濟(jì)生散濃度梯度對(duì)BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞的影響 在BEAS-2B 細(xì)胞中(圖1A)，濟(jì)生散刺激24 h 后，1、2 μL 組細(xì)胞活力較PBS 組顯著上升(P<0.05)，4、6、8、10 μL 組與PBS 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，15、20 μL 組較PBS 組顯著下降(P<0.05)。濟(jì)生散刺激48 h 后，2 μL 組細(xì)胞活力較PBS 組顯著上升(P<0.05)，1、4、6、8 μL 組與PBS 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，10、15、20 μL 組較PBS 組顯著下降(P<0.05)。濟(jì)生散刺激72 h 后，1 μL 組細(xì)胞活力較PBS 組顯著上升(P<0.05)，2、4、6、8、10 μL 組與PBS 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，15、20 μL 組較PBS 組顯著下降(P<0.05)。

在A549 細(xì)胞中(圖1B)，濟(jì)生散刺激24 h 后，濟(jì)生散所有組細(xì)胞活力均較PBS 組顯著下降(P<0.05)。濟(jì)生散刺激48 h 后，1 μL 組細(xì)胞活力較PBS 組有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他組均顯著降低(P<0.05)。濟(jì)生散刺激72 h 后，濟(jì)生散所有組細(xì)胞活力均較PBS 組顯著下降(P<0.05)。

在H1975 細(xì)胞中(圖1C)，濟(jì)生散刺激24、48、72 h 后，濟(jì)生散所有組細(xì)胞活力均較PBS 組明顯下降(P<0.05)。

圖1 濟(jì)生散濃度梯度對(duì)BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞活力的影響

2.2 濟(jì)生散時(shí)間梯度對(duì)BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞的影響 在BEAS-2B 細(xì)胞中(圖2A)，濟(jì)生散2 μL刺激2、4、6、8 h 后，細(xì)胞活力有所上升(P<0.05)；刺激10、12、24 h 后，細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；若持續(xù)刺激至48、72 h 時(shí)，活力顯著下降(P<0.05)。在A549 細(xì)胞中(圖2B)，濟(jì)生散2 μL 刺激2 h 后，細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；濟(jì)生散2 μL 刺激4 h 后，細(xì)胞活力在48 h 和72 h 時(shí)顯著降低(P<0.05)；濟(jì)生散2 μL 刺激6 h 及更長時(shí)間后，細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)。在H1975 細(xì)胞中(圖2C)，濟(jì)生散2 μL 刺激2 h 及更長時(shí)間后，細(xì)胞活力均顯著下降(P<0.05)。

圖2 濟(jì)生散時(shí)間梯度對(duì)BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞的影響

2.3 A549、H1975 細(xì)胞形態(tài)觀察 中藥濟(jì)生散濃度煎至2 g·mL-1，32 μL 刺激A549、H1975 細(xì)胞8 h，以PBS 刺激為對(duì)照。培養(yǎng)24 h 后倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，A549 細(xì)胞呈上皮樣、多角形貼壁生長，H1975 細(xì)胞呈上皮樣、長梭形貼壁生長，A549(圖3)、H1975(圖4)濟(jì)生散組細(xì)胞數(shù)量顯著減少，80%以上皺縮變圓，折光率發(fā)生變化，且貼壁不牢。

圖3 相差顯微鏡下A549 細(xì)胞形態(tài)觀察

圖4 相差顯微鏡下H1975 細(xì)胞形態(tài)觀察

2.4 濟(jì)生散對(duì)BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞活力的影響 中藥濟(jì)生散濃度煎至2 g·mL-1，2 μL 刺激BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞8 h，以PBS 刺激為對(duì)照，CCK8 法檢測細(xì)胞增殖水平(圖5)。結(jié)果顯示：濟(jì)生散處理后，BEAS-2B 細(xì)胞活力無影響，A549 和H1975 增殖水平均顯著下降(P<0.05)。

圖5 濟(jì)生散對(duì)BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞增殖的影響

2.5 濟(jì)生散對(duì)A549、H1975 細(xì)胞周期的影響 PI單染流式細(xì)胞術(shù)分析濟(jì)生散處理后BEAS-2B、A549和H1975 細(xì)胞周期中各時(shí)期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，BEAS-2B 細(xì)胞在濟(jì)生散處理后無明顯變化(圖6A)；A549細(xì)胞在濟(jì)生散處理后(圖6B)，G1期細(xì)胞比例顯著下降(P<0.05)；S 期細(xì)胞比例顯著上升(P<0.01)；G2期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。H1975 細(xì)胞在濟(jì)生散處理后(圖6C)，G1期細(xì)胞比例顯著下降(P<0.01)；G2期、S 期細(xì)胞比例顯著上升(P<0.01)。說明濟(jì)生散可顯著影響A549 和H1975 細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，并使細(xì)胞周期阻滯于S 期。

圖6 濟(jì)生散對(duì)BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞周期的影響

2.6 濟(jì)生散對(duì)BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞凋亡的影響 通過流式分析檢測發(fā)現(xiàn)，與PBS 組相比，濟(jì)生散處理后，BEAS-2B 細(xì)胞無明顯變化(圖7A)；A549細(xì)胞早期凋亡比例極顯著上升(P＜0.01)(圖7B)；H1975細(xì)胞的凋亡比例無論是早期凋亡還是晚期凋亡均顯著上升(P＜0.05)(圖7C)。說明濟(jì)生散可顯著促進(jìn)A549和H1975 細(xì)胞的凋亡。

圖7 濟(jì)生散對(duì)BEAS-2B、A549、H1975 細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

近年來，世界范圍內(nèi)肺癌死亡率呈增加趨勢，且逐步成為死亡率上升最快的癌癥[4]。目前，肺癌的主要治療手段仍然是手術(shù)治療、化療放療、靶向治療、免疫治療等，但其生存率仍不理想[5]。中醫(yī)中藥在我國已有千年歷史，肺癌在中醫(yī)學(xué)中屬于“肺積”、“咳嗽”、“息賁”、“咯血”、“胸痛”、“肺巖”等范疇。肺癌患者主要癥狀有咳嗽、咯痰、疲倦、乏力、氣促、口干、胸痛、頭痛、頭暈、納呆、眠差等表現(xiàn)。中醫(yī)在肺癌的治療方面具有顯著優(yōu)勢，就病因病理機(jī)制而言，肺癌是因虛得病，正虛不僅是肺癌發(fā)生的內(nèi)因，也是肺癌之疾傳變的重要因素。中醫(yī)認(rèn)為，肺為嬌臟，喜潤惡燥，邪毒蘊(yùn)肺，極易耗傷肺氣，灼傷肺陰，同時(shí)，肺癌患者常因手術(shù)、放療、化療及疾病本身的發(fā)展和惡化，嚴(yán)重耗竭人體的氣血津液，故肺極易出現(xiàn)陰虛因素的證候。氣陰虧虛貫穿肺癌發(fā)病始終，益氣養(yǎng)陰是中醫(yī)藥治療肺癌之本，也是目前的主要治法。

因此，中藥扶正散瘤應(yīng)貫穿肺癌治療的始終。扶正以益氣養(yǎng)陰為主，兼以補(bǔ)虛；散瘤以清熱解毒兼以活血化瘀。南通市中醫(yī)院腫瘤科自創(chuàng)濟(jì)生散用于肺癌治療，臨床療效良好[3]，但其作用機(jī)制及影響因素有待進(jìn)一步研究。

本研究以此濟(jì)生散方煎劑用于細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)BEAS-2B 細(xì)胞在作用濃度＜2 μL，時(shí)間＜8 h時(shí)，細(xì)胞活力有所上升，這可能是由于本方所用藥物多是天然藥物，且有溫補(bǔ)功效，促進(jìn)了細(xì)胞的活力；當(dāng)作用濃度＞15 μL，時(shí)間延至48 h 時(shí)，細(xì)胞活力下降，這是因?yàn)閯┝砍^一定的限度，產(chǎn)生了毒副作用，引起細(xì)胞死亡。A549 細(xì)胞在濟(jì)生散2 μL 刺激4 h 后，細(xì)胞活力會(huì)有所下降；H1975 細(xì)胞在濟(jì)生散2 μL 刺激2 h 后，細(xì)胞活力下降。兩種細(xì)胞產(chǎn)生效果的作用濃度和時(shí)間略有不同，但均可在低濃度和短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生效果。最終確定選用2 μL 刺激8 h，對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞無影響，但顯著影響A549、H1975細(xì)胞的活力。細(xì)胞形態(tài)一定程度上也可反映細(xì)胞的狀態(tài)，A549、H1975 濟(jì)生散組細(xì)胞80%以上皺縮變圓，且貼壁不牢，說明濟(jì)生散可顯著影響A549 和H1975 的活力。

細(xì)胞增殖、周期和凋亡是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程，受到精準(zhǔn)而復(fù)雜的調(diào)控。腫瘤正是由于細(xì)胞周期失控所引起的[6]，正常細(xì)胞只在受到生長刺激信號(hào)或促分裂信號(hào)時(shí)才進(jìn)行增殖，腫瘤細(xì)胞則是周期紊亂導(dǎo)致細(xì)胞增殖過多和凋亡過少。細(xì)胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖及遺傳的基礎(chǔ)。細(xì)胞凋亡則是生物體細(xì)胞主動(dòng)消亡的過程，是維持機(jī)體平衡的關(guān)鍵。濟(jì)生散可以幫助機(jī)體恢復(fù)自我調(diào)節(jié)能力，調(diào)整體內(nèi)系統(tǒng)平衡。BEAS-2B 細(xì)胞在濟(jì)生散作用后，增殖、周期和凋亡無明顯變化，說明濟(jì)生散在該濃度時(shí)間作用下，對(duì)正常細(xì)胞無顯著影響。G1期是為DNA 復(fù)制做好物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備，S 期是DNA 合成期，G2期合成RNA 和蛋白質(zhì)。A549、H1975 細(xì)胞經(jīng)濟(jì)生散處理后，G1期細(xì)胞顯著下降，物質(zhì)和能量準(zhǔn)備不足；S期、G2期細(xì)胞顯著上升，阻滯于S、G2期，不能進(jìn)行下一次的細(xì)胞分裂，減少細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致細(xì)胞衰老死亡，從而抑制A549、H1975 細(xì)胞的生長。本研究亦發(fā)現(xiàn)濟(jì)生散處理后A549、H1975 細(xì)胞活力顯著下降，而凋亡水平顯著上升，這與周期結(jié)果一致。提示濟(jì)生散對(duì)肺癌生長有良好的抑制作用，在臨床上具有較好的應(yīng)用前景。但濟(jì)生散是如何抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞凋亡，能否影響及如何影響A549 和H1975細(xì)胞的遷移和侵襲等功能，還有待進(jìn)一步研究。