曹 靜，向雅婷，孫 玥，王 帆，吳紅肖，戴 璐，韓怡婷，褚少朋，俞 娟,***

(1 南通大學附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，南通 226001；2 南通大學公共衛(wèi)生學院醫(yī)學檢驗系)

銅綠假單胞菌是院內(nèi)感染極其常見的機會性致病菌之一，有多種毒力因子包括黏附素、侵襲性酶類、多糖莢膜樣物質(zhì)、綠膿菌素以及內(nèi)、外毒素等，易使銅綠假單胞菌侵入人體并擴散引起感染，導(dǎo)致休克、酸中毒、膿毒血癥、白細胞減少等癥狀[1-2]。銅綠假單胞菌天然耐藥且耐藥機制復(fù)雜，易對臨床常用抗生素產(chǎn)生耐藥性[3-4]。因此開發(fā)新的抗生素種類，使用非抗生素藥物或采取新的抗生素組合方案，對臨床治療多藥耐藥銅綠假單胞菌具有重大意義。

銅綠假單胞菌的耐藥機制復(fù)雜，一方面由于細菌的外膜屏障、多藥外排轉(zhuǎn)運蛋白的存在以及內(nèi)源性抗微生物滅活作用，銅綠假單胞菌對許多抗生素具有固有耐藥[5-6]。另一方面，由于抗生素的廣泛使用，多重耐藥銅綠假單胞菌分離率居高不下，耐藥情況嚴峻。其耐藥機制[7-8]有：(1)細胞膜通透性改變：①細胞膜上外排泵高表達；②膜孔道蛋白丟失或低表達；(2)生物膜形成，細菌能通過生物被膜的形式生存，逃避機體免疫和抗菌藥物的殺傷作用；(3)作用靶點改變：①青霉素結(jié)合蛋白改變導(dǎo)致青霉素類藥物耐藥；②DNA 拓撲酶Ⅱ和Ⅳ結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致對氟喹諾酮藥物耐藥；(4)產(chǎn)生滅活酶或修飾酶：①產(chǎn)生氨基糖苷類鈍化酶，這種鈍化酶與未鈍化的氨基糖苷類競爭細菌細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)使其無法與核糖體結(jié)合，使得銅綠假單胞菌對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥性；②產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶使銅綠假單胞菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥[9]。

目前臨床上用于銅綠假單胞菌治療的藥物包括青霉素類、碳青霉烯類、頭孢菌素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類以及喹諾酮類等六大類，但對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、一、二代頭孢、頭孢替坦、四環(huán)素類、甲氨芐啶等藥物天然耐藥，臨床用藥時應(yīng)先排除這些藥物的使用。銅綠假單胞菌易對多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的特性常使臨床治療陷入困境[7]。選擇合適的聯(lián)合用藥可獲得較好的臨床療效，研究聯(lián)合用藥可為臨床用藥提供合理的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集南通大學附屬醫(yī)院臨床分離的多重耐藥銅綠假單胞菌株共103 株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923。妥布霉素(Tobramycin,TOB)藥敏紙片(Oxoid 公司)、亞胺培南(Imipenem,IPM)藥敏紙片(Oxoid 公司)、哌拉西林/他唑巴坦(Piperacillin/Tazobactam,TZP)藥敏紙片(Oxoid公司)、頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ)藥敏紙片(Oxoid公司)、阿奇霉素(Azithromycin,AZM)藥敏紙片(Oxoid公司)、TOB 化學試劑(Sigma 公司)、IPM 化學試劑(Sigma 公司)。培養(yǎng)基為M-H 平板(Oxioid 公司)和CAMHB 肉湯(Oxoid 公司)；所用儀器包括96 孔板(Corning 公司)、比濁儀(梅里埃公司)、微量加樣槍(Eppendorf 公司)、震蕩儀(IKA 公司)、離心機(Hitachi公司)等。

1.2 研究方法 標本的采集、運輸、分離培養(yǎng)等過程均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行。體外抗菌藥物敏感試驗(antimicrobial susceptibility test,AST)采用WHO 推薦使用的紙片擴散法，為定性藥敏試驗，折點按照最新公布的美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)文件(M100 版本)標準進行判讀，量取抑菌圈并作出敏感、中介和耐藥的判斷。

1.3 實驗方法 使用世界衛(wèi)生組織細菌耐藥性監(jiān)測中心推薦的WHONET5.5 進行數(shù)據(jù)分析。首先采取K-B 法藥敏試驗檢測聯(lián)合用藥組合效果，配制0.5 麥氏單位的菌懸液，涂布于瓊脂平板上，室溫放置，干燥5 min，將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，孵育過夜后觀察抑菌圈形狀：若兩藥抑菌圈交界角平直或無抑菌作用的兩藥之間出現(xiàn)抑菌區(qū)，提示兩藥聯(lián)合效果為協(xié)同作用；若出現(xiàn)兩藥抑菌圈交界角鈍圓，提示兩藥聯(lián)合效果為累加作用。篩選出具有協(xié)同作用的藥物組合。然后采用棋盤稀釋法，將篩選出的TOB 和IPM 配制遞減濃度的藥液：以2 倍最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)作為最高藥物濃度，依次倍比稀釋得到6～8 個稀釋度；挑選孵育了18～24 h 的菌落，使用M-H 肉湯增菌4～6 h，制備0.5 麥氏單位的菌懸液，用生理鹽水稀釋使菌懸液的最終含菌量為105CFU/mL；在96 孔板中各孔加入遞減濃度的抗菌藥物和稀釋好的菌液，單獨用藥時每孔加75 μL 抗菌藥物和75 μL 菌液，聯(lián)合用藥時每孔加不同稀釋濃度的37.5 mL TOB、37.5 μL IPM 和75 μL 菌液，TOB 和IPM 分別在縱列和橫列進行，得到不同濃度組合的混合藥物，置于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)16～20 h 后觀察并記錄單獨使用TOB、IPM 及聯(lián)合使用時的MIC，并以此為基礎(chǔ)計算TOB 和IPM 聯(lián)合用藥的部分抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index,FICI)。最后，檢測并繪制TOB 和IPM 單獨及聯(lián)合使用時的殺菌曲線。

2 結(jié) 果

2.1 不同標本來源的臨床銅綠假單胞菌對常用抗菌藥物的耐藥性 對來自分泌物、痰液、尿液、血液4 種標本的菌株耐藥性進行對比分析，分析的抗菌藥物為4 種標本來源菌株常用的抗菌藥物中相同的部分。由圖1 可見來自痰液標本的銅綠假單胞菌對各種抗菌藥物的耐藥率均高于來源于其他部位的菌株，其次為尿液中分離出的菌株，血液標本中分離出的銅綠假單胞菌除了替卡西林/克拉維酸、TZP、環(huán)丙沙星和左旋氧氟沙星外，對其余常用抗菌藥物的耐藥性均高于分泌物中分離出來的菌株。

圖1 不同標本來源的臨床銅綠假單胞菌對常用抗菌藥物的耐藥性

2.2 多種藥物組合對臨床多藥耐藥銅綠假單胞菌有協(xié)同作用 TOB 與IPM、TZP 與AZM、CAZ 與IPM聯(lián)合用藥對銅綠假單胞菌具有協(xié)同作用；TZP 與IPM、TZP 與CAZ、CAZ 與AZM、IPM 與AZM 聯(lián)合用藥組合對銅綠假單胞菌具有累加作用。

圖2 K-B 法初篩藥敏結(jié)果

2.3 TOB 和IPM 可協(xié)同抑制銅綠假單胞菌活性對TOB 與IPM 進行聯(lián)合藥敏試驗。觀察并記錄TOB和IPM 兩種藥物單獨使用時和聯(lián)合使用時的MIC，并以此為基礎(chǔ)計算FICI，在103 株銅綠假單胞菌中，TOB 和IPM 聯(lián)合使用時FICI≤0.5(協(xié)同作用)的有17 株(16.5%)；FICI 為0.5～1(累加作用)的有37 株(35.9%)；FICI 為1～2(無關(guān)作用)的有49 株(47.6%)[10]。未檢測到該兩藥有拮抗作用的試驗菌株。由圖3 可見TOB 和IPM 聯(lián)合用藥時可顯示協(xié)同作用。

圖3 TOB 與IPM 48 h 殺菌曲線

3 討 論

銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，易引起各種急慢性感染，在感染過程中極易生成生物膜，為菌體帶來一定的保護并抵御抗生素的作用[11]。且由于銅綠假單胞菌含有多種毒力因子，多繼發(fā)于大面積燒傷、白血病、淋巴瘤、惡性腫瘤、靜脈導(dǎo)管、心瓣膜置換術(shù)及各種嚴重慢性疾病等，感染難以根除。其引起的敗血癥占革蘭陰性桿菌敗血癥7%～18%，居第3或第4 位，其死亡率則居革蘭陰性桿菌敗血癥的首位[12]?；颊吒腥俱~綠假單胞菌后常使用抗生素，除需避免使用某些對該菌天然耐藥的抗生素外，由于銅綠假單胞菌極易對一些原先敏感的抗菌藥物在治療過程中產(chǎn)生耐藥性，所以在治療過程中需對臨床分離的銅綠假單胞菌株進行多次體外藥物敏感試驗，及時換用敏感性高的藥物，以免延誤治療。

銅綠假單胞菌對幾種臨床治療時常用的抗菌藥物的耐藥性與其臨床分離部位有一定的關(guān)系，來自痰液標本的銅綠假單胞菌對所選取各種抗菌藥物的耐藥率均高于來源于其他部位的菌株，尿液中分離出的菌株耐藥率僅次于痰液中分離出的菌株，而血液標本中分離出的銅綠假單胞菌除了對替卡西林/克拉維酸、TZP、環(huán)丙沙星和左旋氧氟沙星外，對其余常用抗菌藥物的耐藥率也均高于分泌物中分離出來的菌株。痰液中分離出的銅綠假單胞菌耐藥率高于其他類型標本的原因可能是因為呼吸道感染是銅綠假單胞菌常見的感染方式，但也不排除有定植的可能。因為銅綠假單胞菌是慢性囊性纖維化患者肺部感染常見的病原菌，所以痰液可能是一種十分適合銅綠假單胞菌生長的營養(yǎng)來源。痰液的成分復(fù)雜，有炎性物質(zhì)(白細胞、由于血管滲漏和肺出血進入氣道的各種蛋白)、細菌和細菌產(chǎn)物，且痰液的成分在感染期間多變[13]。囊性纖維化患者痰液中有高濃度的蛋白質(zhì)和氨基酸，可能成為銅綠假單胞菌的碳源和氮源[14]。銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)復(fù)雜，涉及各種信號分子，喹諾酮信號分子(Pseudomonas quinolone signal,PQS)是其中之一。研究[15]表明囊性纖維化患者痰液中有成分可誘導(dǎo)PQS 的相關(guān)基因，使痰液中PQS 水平提高了5 倍。

隨著銅綠假單胞菌對多種抗菌藥物耐藥率的升高，必要時選擇合適的聯(lián)合用藥可取得較好的治療效果，為臨床提供更合理的用藥指導(dǎo)。其中氨基糖苷類和碳青霉烯類抗生素是目前臨床上治療銅綠假單胞菌的常用藥物[16]。

本實驗采用K-B 法進行聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果顯示TOB 與IPM、TZP 與AZM、CAZ 與IPM、TZP 與IPM、TZP 與CAZ、CAZ 與AZM、IPM 與AZM 聯(lián)合用藥具有協(xié)同或累加作用，選取其中TOB 與IPM 進行進一步的棋盤稀釋法聯(lián)合藥敏試驗。

TOB 是氨基糖苷類藥物的一種，常用于革蘭陰性桿菌引起感染的治療，該藥物能聯(lián)結(jié)在細菌的30S 和50S 的聯(lián)結(jié)位置，阻止形成70S 復(fù)合物，導(dǎo)致mRNA 翻譯成蛋白質(zhì)的過程受到阻礙，從而導(dǎo)致細菌死亡。銅綠假單胞菌耐藥的主要原因包括細胞膜通透性低、主動外排泵的過度表達，將異二聚體的利福平與TOB 聯(lián)合治療銅綠假單胞菌，可以打破因為以上兩種原因引起的固有耐藥，并增強了臨床多藥耐藥銅綠假單胞菌對多西環(huán)素和氯霉素的敏感性[17]。此外將TOB 與克拉霉素聯(lián)合，可協(xié)同治療囊性纖維化患者由于銅綠假單胞菌而引起的感染[18]。將TOB 制成納米顆粒的藥物復(fù)合物，對黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌分離株抗菌活性都比單獨使用TOB 治療高[19]。所以TOB 單獨用藥可能易使銅綠假單胞菌產(chǎn)生耐藥而使治療效果不明顯，需與臨床其他抗菌藥物聯(lián)合使用降低耐藥風險提高治療效果。

IPM 是碳青霉烯類抗生素的一種，與TOB 相似的是，該藥物在臨床治療中也可用于革蘭陰性桿菌引起感染的治療。IPM 具有碳青霉烯環(huán)，抗菌譜廣且抗菌作用強，對各種細菌的青霉素結(jié)合蛋白都表現(xiàn)出較好的親和力。多黏菌素B 通常是治療多藥耐藥銅綠假單胞菌的最后的方案，但是帶來急性腎損傷的風險很高。有研究[20]指出，IPM 與利福平聯(lián)合使用可以替代多黏菌素B 成為腎功能不全患者安全的治療方案。使用阿米卡星治療多藥耐藥銅綠假單胞菌時加入IPM 能增加阿米卡星的治療效果[21]。但IPM在單獨使用時在體內(nèi)的穩(wěn)定性比較差，大部分都有被腎細胞膜所產(chǎn)生的腎脫氫肽酶分解破壞的可能性。將IPM 與其他藥物聯(lián)合使用可能可以減少被分解的程度，提高治療效果。

鑒于多藥耐藥銅綠假單胞菌感染所帶來的嚴重性、單一抗生素療法帶來的耐藥風險的增加和新抗生素開發(fā)所需時間長等，使聯(lián)合用藥治療多藥耐藥銅綠假單胞菌成為目前的研究熱點[22]。本研究結(jié)果顯示，TOB 和IPM 聯(lián)合使用出現(xiàn)了16.5%的協(xié)同作用、35.9%的累加作用，47.6%的無關(guān)作用，但未出現(xiàn)拮抗作用。有研究[23]也選用TOB 和IPM 這一組合，對3 株耐碳青霉烯類的銅綠假單胞菌臨床分離菌株進行單一治療和聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥效果明顯優(yōu)于兩者單獨用藥。隨后通過一種基于藥代動力學和藥效動力學的數(shù)學模型對此藥物組合的治療方案進行優(yōu)化，在小鼠大腿感染耐IPM 和TOB 銅綠假單胞菌的動物模型中，也得到了相似的結(jié)論，且該模型顯示TOB 可將IPM 作用靶點的濃度最高提高至原來的2.6 倍[24-25]。證明了TOB 和IPM 這組抗生素組合在臨床上有廣闊的應(yīng)用前景。對于部分沒有明顯協(xié)同作用的菌，可能耐藥機制存在差異。

綜上，TOB 和IPM 聯(lián)合用藥對銅綠假單胞菌具有協(xié)同作用，未發(fā)現(xiàn)拮抗作用，從TOB 和IPM 單獨及聯(lián)合使用時的殺菌曲線可見這兩種藥物聯(lián)合作用時協(xié)同作用明顯，后續(xù)將擴大樣本量進行檢測，并進一步探討其具體作用機制，以期為臨床抗銅綠假單胞菌感染提供新的用藥信息。