徐赟霞　王禹　韓進(jìn)剛　陳浩楠　馮守明

摘要：為確定天津市某養(yǎng)殖場(chǎng)血鸚鵡（Cichlasoma var.）發(fā)病死亡的原因，并對(duì)其進(jìn)行有效的預(yù)防與治療，本試驗(yàn)對(duì)患病的血鸚鵡進(jìn)行病原的分離鑒定、回歸感染及藥敏試驗(yàn)。從病灶處分離出一株疑似病原菌命名為XYW-1，經(jīng)人工感染后具有致病性，臨床癥狀與自然發(fā)病癥狀一致，半致死濃度為4.75×10 5 CFU/mL;經(jīng)生化鑒定和16S rDNA序列分析，XYW-1為遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）;以18種抗生素對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌進(jìn)行了藥物敏感性測(cè)定，結(jié)果顯示遲緩愛(ài)德華氏菌僅對(duì)頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿莫西林、氨曲南、多西環(huán)素、氟苯尼考、氯霉素7種藥物敏感。

關(guān)鍵詞：血鸚鵡（Cichlasoma var.）;遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）;分離鑒定;藥敏試驗(yàn)

遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）為腸桿菌科愛(ài)德華菌屬的革蘭氏陰性短桿菌，有鞭毛，無(wú)莢膜，也不形成芽孢，廣泛存在于溪水、湖泊和海洋等水環(huán)境中，能感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥(niǎo)類甚至哺乳類動(dòng)物[1-2]，遲緩愛(ài)德華氏菌是愛(ài)德華氏菌屬中唯一能夠感染人的致病菌，它能引起人的腸胃炎、腹瀉等，較嚴(yán)重的還可以引起腦膜炎和敗血癥等疾病[3]。近年來(lái)遲緩愛(ài)德華氏菌對(duì)魚類健康的危害越來(lái)越嚴(yán)重，研究者們?cè)诎唏R魚[1]、大菱鲆[4]、斑點(diǎn)叉尾鮰、鯉魚、日本鰻鱺、尼羅羅非魚、漠斑牙鲆[5]、鱖魚[6]、雜交鱧[7]、黃鱔[8]等中都發(fā)現(xiàn)有遲緩愛(ài)德華氏菌感染。

血鸚鵡（Cichlasoma var.）又名紅財(cái)神、發(fā)財(cái)魚和財(cái)神魚，屬于淡水熱帶觀賞魚，由于其顏色鮮艷，形態(tài)可愛(ài)、抗病力強(qiáng)，對(duì)溫度適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)深受天津市市民喜愛(ài)，成為天津地區(qū)主要觀賞魚養(yǎng)殖品種。但是隨著養(yǎng)殖密度的不斷提高，病害也逐年增加，給養(yǎng)殖戶造成經(jīng)濟(jì)損失，有報(bào)道血鸚鵡感染嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌[9-10]等，但至今尚未見(jiàn)有血鸚鵡感染遲緩愛(ài)德華氏菌的報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)患病血鸚鵡進(jìn)行病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，以期能夠找出血鸚鵡發(fā)病原因并提供用藥指導(dǎo)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中防治遲緩愛(ài)德華菌病提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

患病的和健康的血鸚鵡均來(lái)自天津市寶坻區(qū)某觀賞魚養(yǎng)殖場(chǎng)，腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、水解酪蛋白培養(yǎng)基（MH）、藥敏紙片均購(gòu)自O(shè)xoid公司;VITEK GN鑒定卡購(gòu)自法國(guó)梅里埃生化公司;PCR所用的試劑購(gòu)于普洛麥格（Promega）生物技術(shù)有限公司。

1.2病原菌的分離與純化

在無(wú)菌條件下，從患病的血鸚鵡肝臟、脾臟、腎臟中取樣，劃線接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃培養(yǎng)24 h后，選擇從腎臟中分離的優(yōu)勢(shì)菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上劃線純化，直至獲得純培養(yǎng)的菌株，轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，備用。

1.3人工感染試驗(yàn)

將健康的鸚鵡魚（體長(zhǎng)8.76 cm±0.64 cm，體重47.21 g±2.67 g）暫養(yǎng)1周，水溫保持在27～28 ℃，無(wú)異常情況后進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。將50尾健康的鸚鵡魚平均分成5組，將XYW-1菌株用生理鹽水洗脫分別制成3×108、3×107、3×106、3×105 CFU/mL的菌懸液，取以上4個(gè)濃度的菌懸液，按照0.1 mL/尾的劑量用無(wú)菌注射器對(duì)血鸚鵡進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組注射0.1 mL的生理鹽水，持續(xù)觀察5 d，并記錄好死亡情況，對(duì)患病的血鸚鵡進(jìn)行病原菌的分離鑒定，根據(jù)寇氏法[11]計(jì)算半致死劑量。

1.4生理生化鑒定

將病原菌接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，鏡下觀察其形態(tài)特征。在無(wú)菌條件下挑取單個(gè)菌落制成菌懸液，采用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)和VITEK GN鑒定卡對(duì)其進(jìn)行生理生化特性測(cè)定。

1.516S rDNA基因序列鑒定及發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

挑取單個(gè)菌落于30 μL去離子水中，100 ℃金屬浴10 min后，12 000 r/min離心1 min后取上清作為PCR模板。16S rRNA序列擴(kuò)增引物27 F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1 492 R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 20 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送金唯智生物科技（天津）有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI中BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行在線比對(duì)，選取與其同屬的細(xì)菌16S rDNA基因序列，用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。選用鄰位相連法（Neighbor-joining）獲得系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)自舉分析（Bootstraping）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的評(píng)估自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.6藥敏試驗(yàn)

將菌株用生理鹽水稀釋到0.5麥?zhǔn)蠞舛龋脽o(wú)菌的棉拭子蘸取稀釋好的菌懸液均勻涂布于MH平板上，待平板表面干燥后，用鑷子將藥敏紙片輕輕放置在平板表面并壓緊，放置在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后用直尺量取抑菌圈直徑，試驗(yàn)結(jié)果判斷參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[12]。

2結(jié)果

2.1臨床癥狀及病原菌形態(tài)特征

患病的血鸚鵡主要表現(xiàn)為體表出血、潰爛，鱗片脫落，胸鰭基部腫脹，剖開(kāi)魚腹，病魚肝臟、腎臟明顯腫大，脾臟失血呈粉紅色。從腎臟中分離獲得的優(yōu)勢(shì)菌株XYW-1為革蘭氏陰性短桿菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落為正圓形、灰白色、表面濕潤(rùn)、邊緣整齊、凸起。

2.2人工感染試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)人工感染發(fā)病血鸚鵡的主要臨床癥狀與自然感染菌株的癥狀相似，其體表出血，鰓絲充血、有明顯的潰爛。從死亡的血鸚鵡的腎臟中分離到的菌株經(jīng)鑒定后與XYW-1一致，而注射無(wú)菌生理鹽水的對(duì)照組無(wú)死亡現(xiàn)象，外觀特征無(wú)明顯變化，由此可以說(shuō)明菌株XYW-1是引起血鸚鵡發(fā)病死亡的病原菌。根據(jù)寇氏法計(jì)算可知菌株對(duì)血鸚鵡的半致死劑量為4.75×105 CFU/mL（表1）。

2.3病原菌的生化特征

使用VITEK GN鑒定卡對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定，生理生化反應(yīng)見(jiàn)表2。XYW-1符合遲緩愛(ài)德華氏菌生理生化特性，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)和生理生化結(jié)果可初步判定分離菌XYW-1為遲緩愛(ài)德華氏菌。

2.416S rDNA基因序列分析結(jié)果

病原菌XYW-1所擴(kuò)增的16SrDNA基因序列長(zhǎng)度為1 389 bp，以 NCBI 的 Blast 檢索系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行序列同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，XYW-1與愛(ài)德華氏菌屬自然聚類，并與檢索出的遲緩愛(ài)德華氏菌聚為一支，同源性高達(dá)99%以上。綜合生理生化鑒定結(jié)果和16S rDNA基因序列分析結(jié)果，確定菌株XYW-1為遲緩愛(ài)德華氏菌。

2.5藥敏試驗(yàn)結(jié)果

從表3可以看出，菌株XYW-1對(duì)頭孢類的頭孢噻肟、頭孢吡肟，內(nèi)酰胺類的阿莫西林、氨曲南，四環(huán)素類的多西環(huán)素和氯霉素類的氟苯尼考、氯霉素敏感;對(duì)頭孢呋辛、鏈霉素、新霉素和利福平中度敏感;而對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、阿奇霉素、紅霉素、四環(huán)素和磺胺甲惡唑耐藥。

3討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者關(guān)于血鸚鵡細(xì)菌性疾病也有相關(guān)報(bào)道： 錢曉宇等[9]發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌感染血鸚鵡，臨床表現(xiàn)為體表出血，腹部腫大，鰓絲充血腫脹，肝臟腫大糜爛。梁利國(guó)等[10]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌感染血鸚鵡后，病魚眼球腫大、突出，眼瞼呈潰爛狀，肝臟呈黑紅色，膽囊腫大。本研究中對(duì)天津某觀賞魚養(yǎng)殖場(chǎng)病死的血鸚鵡進(jìn)行了較系統(tǒng)的病原研究，從發(fā)病血鸚鵡腎臟分離到優(yōu)勢(shì)菌并作分離純化培養(yǎng)，人工感染試驗(yàn)證實(shí)分離菌能引起健康血鸚鵡發(fā)病與死亡，再分離的細(xì)菌經(jīng)細(xì)菌學(xué)鑒定為同源感染菌，經(jīng)生物學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，分離菌為遲緩愛(ài)德華氏菌。這也是首次在血鸚鵡中分離到遲緩愛(ài)德華氏菌。

在天津市水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)生細(xì)菌性疾病的時(shí)候大多仍采用抗菌藥物來(lái)控制其發(fā)生和流行，有效合理地應(yīng)用抗生素是防治魚類細(xì)菌性疾病的重要措施之一。魚類遲緩愛(ài)德華菌病具有流行范圍廣、發(fā)病率和病死率高等特點(diǎn)[13]，目前已有20多種魚類可感染遲緩愛(ài)德華氏菌并致病?？咕幬锏膹V泛使用，導(dǎo)致其對(duì)多數(shù)抗生素產(chǎn)生耐藥性，本試驗(yàn)中以18種抗生素對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌進(jìn)行了藥物敏感性測(cè)定，結(jié)果顯示遲緩愛(ài)德華氏菌僅對(duì)頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿莫西林、氨曲南、多西環(huán)素、氟苯尼考、氯霉素7種藥物敏感，對(duì)其他藥物都產(chǎn)生了不同程度的耐藥，出現(xiàn)這種情況究其原因多半與濫用抗生素有關(guān)，另外觀賞魚在防治病害時(shí)，不需要考慮藥物殘留的因素，對(duì)抗菌藥物使用劑量和使用頻率問(wèn)題也沒(méi)有限制，也是造成XYW-1對(duì)抗菌藥物敏感性低的原因。本研究試驗(yàn)結(jié)果可作為由該菌引起的血鸚鵡疾病防治選藥時(shí)的參考，在生產(chǎn)養(yǎng)殖中可以使用頭孢噻肟、多西環(huán)素等高敏感藥物進(jìn)行治療。

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Isolation， identification and drug sensitivity test of a strain of Edwardsiella tardata from Cichlasoma var.

XU Yunxia， WANG Yu， Han Jingang ，Chen Haonan，F(xiàn)ENG Shouming

（Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center， Tianjin 300402，China）

Abstract：In order to determine the causes of the disease and death of Cichlasoma var.in Tianjin， and to effectively prevent and treat them， the pathogen isolation and identification， regression infection and drug sensitivity tests were carried out on Cichlasoma var.in this study.A pathogenic bacteria named XYW-1 was isolated from the affected Cichlasoma var.， the artificial infection was pathogenic， and produced the similar clinical symptoms in artificially infected Cichlasoma var.as the naturally infected cases， and LCD was 4.75×105 CFU/mL. By physiological and biochemical analysis and 16S rDNA sequence analysis， XYW-1 was Edwardsiella tarda. In this experiment， 18 antibiotics were used to test the drug sensitivity of Edwardsiella tarda，and the results showed that Edwardsiella tarda was only sensitive to 7 of them， including cefotaxime， cefepime， amoxicillin， amtronam， doxycycline， florfenicol and chloramphenicol.

Key words：Cichlasoma var.; Edwardsiella tarda; isolation and identification; drug sensitivity test

（收稿日期：2021-05-08）