馬赟赟

（甘肅隆宇檢測(cè)科技有限公司，甘肅 蘭州 730070）

馬鈴薯是主要的糧食、蔬菜和飼料,也是淀粉工業(yè)與食品工業(yè)的傳統(tǒng)原料[1,2],馬鈴薯中含有淀粉、蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素及生物堿等。生物堿是馬鈴薯的次生代謝產(chǎn)物，在其芽、幼葉、花、未成熟塊莖及成熟薯皮組織中含量較高，對(duì)抵御病原菌和病蟲侵害有一定的作用，對(duì)某些真菌、細(xì)菌等病原微生物有一定的抑制和殺滅作用，可作為植物抗毒素開發(fā)利用，也可作為開發(fā)綠色農(nóng)藥的原材料。另外，馬鈴薯種的生物堿抵御、驅(qū)趕害蟲等特性還可用于馬鈴薯抗病蟲害新品種的培育。運(yùn)用在雜交育種中，對(duì)培育抵抗性強(qiáng)、產(chǎn)量高、成熟塊莖中生物堿含量低和食用安全性好的新品種意義重大。

近代醫(yī)學(xué)研究表明，馬鈴薯中生物堿與其他甾族生物堿一樣有消炎、強(qiáng)心、平喘、抗過敏調(diào)節(jié)代謝和內(nèi)分泌的作用[3-6]。我國(guó)馬鈴薯種植面積廣，而不被人們重視的薯皮、薯渣中生物堿含量很高，糖苷生物堿資源十分豐富。因此，研究馬鈴薯中生物堿含量的測(cè)定，具有重大的實(shí)用意義。

生物堿通常指茄科和百合科植物產(chǎn)生的具有特殊甾體結(jié)構(gòu)的一類生物堿，有時(shí)也被稱為甾體生物堿(Steroidal Alkaloid)。根據(jù)生物堿苷元的不同結(jié)構(gòu)大致分為茄次堿烷 (solanidanes)、螺旋甾堿烷(spiroslanes)和其他甾體衍生物三類。常見的糖苷生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)和來源如圖1 所示。

圖1 馬鈴薯中主要生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)

對(duì)馬鈴薯糖苷生物堿的提取、分離、純化及測(cè)定方法的研究國(guó)外比較完善，國(guó)內(nèi)報(bào)道很少[7]。將生物堿溶于某些溶劑甲醇、乙醇、吡啶、乙腈、稀酸（乙酸、硫酸、硝酸）中，利用生物堿遇堿（氨水、氫氧化鈉）沉淀的特征對(duì)其進(jìn)行提取純化，然后進(jìn)行測(cè)定。本文采用甲醇提取—氨水沉淀并輔助超聲波震蕩的方法提取馬鈴薯中生物堿，利用電化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。

馬鈴薯中生物堿的電化學(xué)性能的研究，目前國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道。生物堿的測(cè)定方法主要有循環(huán)伏安法[8-9]，薄層層析[10]等，這些方法都需要復(fù)雜的前處理過程、操作煩瑣，靈敏度低等不足。本文利用循環(huán)伏安法和線性掃描伏安法測(cè)定馬鈴薯中生物堿的電化學(xué)性能，通過對(duì)測(cè)定條件的探索，首次利用生物堿線性掃描伏安圖的氧化峰電流與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，以峰電流檢測(cè)其濃度。該方法處理簡(jiǎn)單、靈敏度高，建立了檢測(cè)馬鈴薯中生物堿的新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

馬鈴薯，次氯酸鈉（AR），無水甲醇（AR），濃氨水（AR），石油醚（AR），濃硫酸（AR），氫氧化鈉（AR），卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)樣，石英砂；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.1.2 儀器設(shè)備

CHI832B 電化學(xué)分析儀（上海辰華儀器公司）；實(shí)驗(yàn)采用三電極體系：工作電極為金電極，Ag/AgCl（飽和KCl 溶液）為參比電極，Pt 絲為輔助電極；KH3200 型超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；AnkeTDL 80-2B 臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）；AL104 電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）遠(yuǎn)紅外快速干燥箱（上海申光儀器儀表有限公司）；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空水泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 馬鈴薯中生物堿提取

新鮮的馬鈴薯皮、充分研磨、取70%的甲醇溶液溶解，30℃下超聲波振蕩處理、抽濾、減壓濃縮、然后用2%HCl 溶解、石油醚萃取、濃氨水調(diào)節(jié)pH、離心、沉淀并烘干、沸甲醇迅速溶解后進(jìn)行熱抽濾、減壓濃縮、甲醇溶解、超聲、樣品為馬鈴薯糖苷生物堿的粗樣提取液，待測(cè)。

1.2.2 糖苷生物堿吸光度的測(cè)定

取標(biāo)準(zhǔn)糖苷生物堿樣品，用無水甲醇溶液做參比溶液測(cè)定糖苷生物堿的最大吸光度。

1.2.3 循環(huán)伏安法測(cè)定電化學(xué)

以裸金電極為工作電極，飽和甘汞為參比電極，Pt 絲為輔助電極。工作電極先后用0.3um 和0.05um粒度α-Al2O3在麂皮上打磨拋光，用蒸餾水沖洗電極表面，待電極表面風(fēng)干后測(cè)定。

用循環(huán)伏安法測(cè)試不同電解質(zhì)（KNO3、HAc、H2SO4、KCl）中生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液不同濃度的伏安圖。加入等量最佳電解質(zhì)溶液，檢測(cè)1×10-4mg/mL 生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同pH 下的循環(huán)伏安圖和線性掃描伏安圖。以線性掃描伏安法測(cè)定不同掃描速率下生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰電流ip。

選擇線性掃描伏安法在最佳電解質(zhì)、pH、掃描速率下測(cè)定不同濃度生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和馬鈴薯中生物堿提取物溶液的各峰電流ip。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖苷生物堿吸光度的測(cè)定

同一濃度下測(cè)定波長(zhǎng)在200～350nm 范圍生物堿的吸光光度，如圖2(a)所示，不同濃度下糖苷生物堿的最大吸收峰值，如圖2（b）所示。

圖2 相同濃度不同波長(zhǎng)生物堿的吸光度與不同濃度生物堿與最大吸收峰的關(guān)系

2.2 支持電解質(zhì)的影響

研究了生物堿在4種電解質(zhì)（KNO3、HAc、H2SO4、KCl）中的電化學(xué)行為。通過1mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液加1mL 不同電解質(zhì)溶液（濃度為5mmol/L）的循環(huán)伏安圖比較分析，得到以5mmol/L 的H2SO4溶液作為電解質(zhì)時(shí)循環(huán)伏安圖最理想，且不同濃度下峰電流ip變化穩(wěn)定，可供后續(xù)定量分析。圖3 分別為KNO3(如圖3a 所示)、HAc（如圖3b 所示）、H2SO4（如圖3c 所示）、KCl（如圖3d 所示）做支持電解質(zhì)時(shí)的循環(huán)伏安圖。

圖3 不同電解質(zhì)中卡茄堿的CV 圖

2.3 pH 值的選擇

在相同濃度的1mL 生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入1mL 的5mmol/LH2SO4溶液，對(duì)所得溶液在不同pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0）下進(jìn)行線性掃描伏安測(cè)定，得到不同pH 下的線性掃描伏安圖（如圖4 所示）。結(jié)果表明，生物堿的氧化峰電流ip隨著pH 值有增大而減小的趨勢(shì)（如圖4b 所示），但在pH3.0 時(shí)ip值最大且峰形最好（如圖4a 所示）。綜合考慮氧化峰電流大小和峰形狀，選擇pH3.0 為最佳的測(cè)定pH值。如圖4 所示。

圖4 pH 值對(duì)生物堿的CV 圖（a）和峰電流（b）的影響

2.4 掃描速率的選擇

伏安法測(cè)試生物堿過程中，掃描速率影響測(cè)試的靈敏度和分辨率，根據(jù)掃描速率v 的平方根和氧化峰電流ip成正比關(guān)系，選擇H2SO4溶液作為支持電解質(zhì)、pH 值等于3.0 時(shí)測(cè)定不同掃描速率v（0.0025V/s、0.005V/s、0.01V/s、0.0001V/s、0.05V/s）時(shí)卡茄堿溶液的電化學(xué)行為，確定不同掃描速率v 對(duì)應(yīng)的氧化峰電流ip，通過分析v1/2-ip線性關(guān)系，得到最佳掃描速率v=0.01V/s。如圖5 所示。

圖5 掃描速率的1/2 次方與峰電流的關(guān)系圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取不同濃度1mL 生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1mL的5mmol/LH2SO4溶液，調(diào)整pH 等于3.0，設(shè)置掃描速率v=0.01V/s 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液做線性掃描伏安圖，研究生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的不同濃度c 與氧化峰電流ip的關(guān)系，得到濃度c 在2.00E-05mg/mL-1.00E-04mg/mL 之間有最好的線性關(guān)系（如圖6 所示）。

圖6 LSV 峰電流ip（A）與濃度c（mg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 馬鈴薯中生物堿測(cè)定

移取0.1mL 生物堿的甲醇溶液稀釋至500mL，得到馬鈴薯中生物堿待測(cè)溶液。取1mL 的待測(cè)溶液，加入1mL 的5mmol/L 的H2SO4溶液，調(diào)pH 至3.0，設(shè)定掃描速率v=0.01V/s 時(shí)用線性掃描伏安法測(cè)定馬鈴薯中生物堿溶液的峰電流值ip，根據(jù)ip值計(jì)算得到不同光照處理時(shí)間下的馬鈴薯中生物堿提取物稀釋溶液溶度（見表1）。根據(jù)馬鈴薯中生物堿含量受光照時(shí)間的影響[14]得知表1 中濃度數(shù)據(jù)合理，可供分析。

表1 馬鈴薯中生物堿含量

3 結(jié)論

探索出馬鈴薯中生物堿在波長(zhǎng)為210nm 時(shí)，吸光光度值最大。馬鈴薯中生物堿電化學(xué)研究的最佳條件：支持電解質(zhì)5mmol/L 的H2SO4、pH=3.0、掃描速率0.01V/s。采用循環(huán)伏安法和線性掃描伏安法在最佳條件下,對(duì)馬鈴薯中生物堿進(jìn)行研究。結(jié)果表明，馬鈴薯中生物堿在裸金電極上可產(chǎn)生良好的氧化峰，糖苷生物堿有穩(wěn)定的電化學(xué)性能。研究表明，利用電化學(xué)方法在最佳條件下對(duì)馬鈴薯中生物堿的測(cè)定方法簡(jiǎn)單、靈敏度高，得到了檢測(cè)馬鈴薯中生物堿的新方法。