馬赟赟

（甘肅隆宇檢測科技有限公司，甘肅 蘭州 730070）

馬鈴薯是主要的糧食、蔬菜和飼料,也是淀粉工業(yè)與食品工業(yè)的傳統(tǒng)原料[1,2],馬鈴薯中含有淀粉、蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素及生物堿等。生物堿是馬鈴薯的次生代謝產(chǎn)物，在其芽、幼葉、花、未成熟塊莖及成熟薯皮組織中含量較高，對抵御病原菌和病蟲侵害有一定的作用，對某些真菌、細(xì)菌等病原微生物有一定的抑制和殺滅作用，可作為植物抗毒素開發(fā)利用，也可作為開發(fā)綠色農(nóng)藥的原材料。另外，馬鈴薯種的生物堿抵御、驅(qū)趕害蟲等特性還可用于馬鈴薯抗病蟲害新品種的培育。運(yùn)用在雜交育種中，對培育抵抗性強(qiáng)、產(chǎn)量高、成熟塊莖中生物堿含量低和食用安全性好的新品種意義重大。

近代醫(yī)學(xué)研究表明，馬鈴薯中生物堿與其他甾族生物堿一樣有消炎、強(qiáng)心、平喘、抗過敏調(diào)節(jié)代謝和內(nèi)分泌的作用[3-6]。我國馬鈴薯種植面積廣，而不被人們重視的薯皮、薯渣中生物堿含量很高，糖苷生物堿資源十分豐富。因此，研究馬鈴薯中生物堿含量的測定，具有重大的實用意義。

生物堿通常指茄科和百合科植物產(chǎn)生的具有特殊甾體結(jié)構(gòu)的一類生物堿，有時也被稱為甾體生物堿(Steroidal Alkaloid)。根據(jù)生物堿苷元的不同結(jié)構(gòu)大致分為茄次堿烷 (solanidanes)、螺旋甾堿烷(spiroslanes)和其他甾體衍生物三類。常見的糖苷生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)和來源如圖1 所示。

圖1 馬鈴薯中主要生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)

對馬鈴薯糖苷生物堿的提取、分離、純化及測定方法的研究國外比較完善，國內(nèi)報道很少[7]。將生物堿溶于某些溶劑甲醇、乙醇、吡啶、乙腈、稀酸（乙酸、硫酸、硝酸）中，利用生物堿遇堿（氨水、氫氧化鈉）沉淀的特征對其進(jìn)行提取純化，然后進(jìn)行測定。本文采用甲醇提取—氨水沉淀并輔助超聲波震蕩的方法提取馬鈴薯中生物堿，利用電化學(xué)方法對其進(jìn)行定量測定。

馬鈴薯中生物堿的電化學(xué)性能的研究，目前國內(nèi)還未見報道。生物堿的測定方法主要有循環(huán)伏安法[8-9]，薄層層析[10]等，這些方法都需要復(fù)雜的前處理過程、操作煩瑣，靈敏度低等不足。本文利用循環(huán)伏安法和線性掃描伏安法測定馬鈴薯中生物堿的電化學(xué)性能，通過對測定條件的探索，首次利用生物堿線性掃描伏安圖的氧化峰電流與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，以峰電流檢測其濃度。該方法處理簡單、靈敏度高，建立了檢測馬鈴薯中生物堿的新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑

馬鈴薯，次氯酸鈉（AR），無水甲醇（AR），濃氨水（AR），石油醚（AR），濃硫酸（AR），氫氧化鈉（AR），卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)樣，石英砂；實驗用水均為二次蒸餾水。

1.1.2 儀器設(shè)備

CHI832B 電化學(xué)分析儀（上海辰華儀器公司）；實驗采用三電極體系：工作電極為金電極，Ag/AgCl（飽和KCl 溶液）為參比電極，Pt 絲為輔助電極；KH3200 型超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；AnkeTDL 80-2B 臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）；AL104 電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）遠(yuǎn)紅外快速干燥箱（上海申光儀器儀表有限公司）；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空水泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬鈴薯中生物堿提取

新鮮的馬鈴薯皮、充分研磨、取70%的甲醇溶液溶解，30℃下超聲波振蕩處理、抽濾、減壓濃縮、然后用2%HCl 溶解、石油醚萃取、濃氨水調(diào)節(jié)pH、離心、沉淀并烘干、沸甲醇迅速溶解后進(jìn)行熱抽濾、減壓濃縮、甲醇溶解、超聲、樣品為馬鈴薯糖苷生物堿的粗樣提取液，待測。

1.2.2 糖苷生物堿吸光度的測定

取標(biāo)準(zhǔn)糖苷生物堿樣品，用無水甲醇溶液做參比溶液測定糖苷生物堿的最大吸光度。

1.2.3 循環(huán)伏安法測定電化學(xué)

以裸金電極為工作電極，飽和甘汞為參比電極，Pt 絲為輔助電極。工作電極先后用0.3um 和0.05um粒度α-Al2O3在麂皮上打磨拋光，用蒸餾水沖洗電極表面，待電極表面風(fēng)干后測定。

用循環(huán)伏安法測試不同電解質(zhì)（KNO3、HAc、H2SO4、KCl）中生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液不同濃度的伏安圖。加入等量最佳電解質(zhì)溶液，檢測1×10-4mg/mL 生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同pH 下的循環(huán)伏安圖和線性掃描伏安圖。以線性掃描伏安法測定不同掃描速率下生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰電流ip。

選擇線性掃描伏安法在最佳電解質(zhì)、pH、掃描速率下測定不同濃度生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和馬鈴薯中生物堿提取物溶液的各峰電流ip。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖苷生物堿吸光度的測定

同一濃度下測定波長在200～350nm 范圍生物堿的吸光光度，如圖2(a)所示，不同濃度下糖苷生物堿的最大吸收峰值，如圖2（b）所示。

圖2 相同濃度不同波長生物堿的吸光度與不同濃度生物堿與最大吸收峰的關(guān)系

2.2 支持電解質(zhì)的影響

研究了生物堿在4種電解質(zhì)（KNO3、HAc、H2SO4、KCl）中的電化學(xué)行為。通過1mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液加1mL 不同電解質(zhì)溶液（濃度為5mmol/L）的循環(huán)伏安圖比較分析，得到以5mmol/L 的H2SO4溶液作為電解質(zhì)時循環(huán)伏安圖最理想，且不同濃度下峰電流ip變化穩(wěn)定，可供后續(xù)定量分析。圖3 分別為KNO3(如圖3a 所示)、HAc（如圖3b 所示）、H2SO4（如圖3c 所示）、KCl（如圖3d 所示）做支持電解質(zhì)時的循環(huán)伏安圖。

圖3 不同電解質(zhì)中卡茄堿的CV 圖

2.3 pH 值的選擇

在相同濃度的1mL 生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入1mL 的5mmol/LH2SO4溶液，對所得溶液在不同pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0）下進(jìn)行線性掃描伏安測定，得到不同pH 下的線性掃描伏安圖（如圖4 所示）。結(jié)果表明，生物堿的氧化峰電流ip隨著pH 值有增大而減小的趨勢（如圖4b 所示），但在pH3.0 時ip值最大且峰形最好（如圖4a 所示）。綜合考慮氧化峰電流大小和峰形狀，選擇pH3.0 為最佳的測定pH值。如圖4 所示。

圖4 pH 值對生物堿的CV 圖（a）和峰電流（b）的影響

2.4 掃描速率的選擇

伏安法測試生物堿過程中，掃描速率影響測試的靈敏度和分辨率，根據(jù)掃描速率v 的平方根和氧化峰電流ip成正比關(guān)系，選擇H2SO4溶液作為支持電解質(zhì)、pH 值等于3.0 時測定不同掃描速率v（0.0025V/s、0.005V/s、0.01V/s、0.0001V/s、0.05V/s）時卡茄堿溶液的電化學(xué)行為，確定不同掃描速率v 對應(yīng)的氧化峰電流ip，通過分析v1/2-ip線性關(guān)系，得到最佳掃描速率v=0.01V/s。如圖5 所示。

圖5 掃描速率的1/2 次方與峰電流的關(guān)系圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取不同濃度1mL 生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1mL的5mmol/LH2SO4溶液，調(diào)整pH 等于3.0，設(shè)置掃描速率v=0.01V/s 對標(biāo)準(zhǔn)溶液做線性掃描伏安圖，研究生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的不同濃度c 與氧化峰電流ip的關(guān)系，得到濃度c 在2.00E-05mg/mL-1.00E-04mg/mL 之間有最好的線性關(guān)系（如圖6 所示）。

圖6 LSV 峰電流ip（A）與濃度c（mg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 馬鈴薯中生物堿測定

移取0.1mL 生物堿的甲醇溶液稀釋至500mL，得到馬鈴薯中生物堿待測溶液。取1mL 的待測溶液，加入1mL 的5mmol/L 的H2SO4溶液，調(diào)pH 至3.0，設(shè)定掃描速率v=0.01V/s 時用線性掃描伏安法測定馬鈴薯中生物堿溶液的峰電流值ip，根據(jù)ip值計算得到不同光照處理時間下的馬鈴薯中生物堿提取物稀釋溶液溶度（見表1）。根據(jù)馬鈴薯中生物堿含量受光照時間的影響[14]得知表1 中濃度數(shù)據(jù)合理，可供分析。

表1 馬鈴薯中生物堿含量

3 結(jié)論

探索出馬鈴薯中生物堿在波長為210nm 時，吸光光度值最大。馬鈴薯中生物堿電化學(xué)研究的最佳條件：支持電解質(zhì)5mmol/L 的H2SO4、pH=3.0、掃描速率0.01V/s。采用循環(huán)伏安法和線性掃描伏安法在最佳條件下,對馬鈴薯中生物堿進(jìn)行研究。結(jié)果表明，馬鈴薯中生物堿在裸金電極上可產(chǎn)生良好的氧化峰，糖苷生物堿有穩(wěn)定的電化學(xué)性能。研究表明，利用電化學(xué)方法在最佳條件下對馬鈴薯中生物堿的測定方法簡單、靈敏度高，得到了檢測馬鈴薯中生物堿的新方法。