陳 蓉，贠丹丹，黃文峰，柴艷梅，劉 丹，陳 群，周 成

(1.荊門(mén)市第二人民醫(yī)院，湖北 荊門(mén) 448000；2.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，陜西 西安 710077；3.西安交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西 西安 710061)

馬兜鈴酸(Aristolochic acids,AAs)天然存在于馬兜鈴屬、馬蹄香屬、細(xì)辛屬、線(xiàn)果兜鈴屬植物中。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，馬兜鈴屬的中草藥具有利尿、抗感染、消炎和抗蛇毒等功效，也可用于支氣管炎、腎炎、前列腺炎等感染性疾病[1]。馬兜鈴酸主要包括馬兜鈴酸-Ⅰ和馬兜鈴酸-Ⅱ兩種形式，其中馬兜鈴酸-Ⅰ是毒性最強(qiáng)的成分。研究表明馬兜鈴酸具有很強(qiáng)的腎毒性，其代謝產(chǎn)物馬兜鈴內(nèi)酰胺也具有腎毒性[2]。此外對(duì)馬兜鈴酸代謝過(guò)程研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸可使RAS基因及P53基因發(fā)生突變，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤[3]。

細(xì)胞凋亡又稱(chēng)細(xì)胞程序性死亡，在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中有重要作用。細(xì)胞凋亡受多基因嚴(yán)格控制，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、Caspase家族、原癌基因C-myc等，但迄今為止細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制尚不明確[4]。精子發(fā)生過(guò)程中生精細(xì)胞的凋亡對(duì)生精過(guò)程具有重要的意義。睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cell，LC)的主要功能表現(xiàn)為通過(guò)T細(xì)胞促進(jìn)精子發(fā)育、雄性生殖器官的發(fā)育分化等[5]。近年來(lái)研究表明LC的凋亡受到多種因素及基因的調(diào)控，主要有Bcl-2、Caspase-3等[6]。有研究表明馬兜鈴酸可以通過(guò)干擾破壞線(xiàn)粒體代謝功能和結(jié)構(gòu)而誘導(dǎo)線(xiàn)粒體損傷[7]。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道含有馬兜鈴酸的中草藥可以引起腎功能損害[8]。但馬兜鈴酸對(duì)LC的凋亡尚未見(jiàn)報(bào)道。我們有必要對(duì)馬兜鈴酸毒理性全面解讀，闡明引發(fā)中藥出現(xiàn)安全性問(wèn)題的因素。本文旨在研究AAs能否誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系TM3細(xì)胞凋亡進(jìn)行了探討，并對(duì)AAs引起細(xì)胞凋亡的意義進(jìn)行討論。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(Gibco，美國(guó))；青-鏈霉素(Gibco，美國(guó))；馬兜鈴酸-Ⅰ(Sigma，美國(guó))，用DMSO溶解；CCK-8(Sigma，美國(guó))；TUNEL(陜西脈元，中國(guó))；Caspase-3、Caspase-9、Bax、β-actin抗體(Abcam，英國(guó))；山羊抗兔IgG(H+L)和山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(Abcam，英國(guó))；BCA 蛋白定量分析試劑盒和ECL 顯影試劑盒(Thermo，美國(guó))。

1.2 儀 器 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Thermo，美國(guó))；Light Cycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche，美國(guó))；CKX53倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TM3細(xì)胞種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的馬兜鈴酸-Ⅰ，并給對(duì)照組加入等體積的DMSO。每孔培養(yǎng)基體積為100 μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別作用24、48、72 h后每孔加入10 μl CCK-8液，37 ℃作用30 min后用酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔OD值。

1.4 TUNEL檢測(cè)凋亡 細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定后加入DNA末端轉(zhuǎn)移酶及帶標(biāo)記的dNTP直接連接到DNA片段的3’-OH端，DAPI染細(xì)胞核，通過(guò)倒置熒光顯微鏡拍照觀(guān)察凋亡小體的數(shù)量檢測(cè)細(xì)胞的凋亡程度。結(jié)果判定：細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞呈綠色。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá) 將細(xì)胞種于6孔板中藥物處理48 h后，加入1 ml Trizol裂解細(xì)胞，再加入200 μl氯仿，4 ℃，12000 g離心15 min，加入等體積異丙醇，4 ℃，12000 g離心10 min，按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物由上海金唯智公司合成。GAPDH基因上游引物：5’-AGAGAGGCCCAGCTACTCG-3’，下游引物： 5’-GGCACTGCACAAGAAGATGC-3’；Caspase-3基因上游引物：5’-GCTGGACTGCGGTATTGAGA-3’，下游引物：5’-TAACCGGGTGCGGTAGAGTA-3’；Caspase-9基因上游引物：5’-GACAAGGCCTTCGACAGTGA-3’，下游引物：5’-CCTGGGAAGGTGGAGTAGGA-3’；Bax基因上游引物：5’-GGTGAACTGGGGGAGGATTG-3’，下游引物：5’-AGAGCGATGTTGTCCACCAG-3’，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，生成溶解曲線(xiàn)，40個(gè)循環(huán)。定量PCR結(jié)果通過(guò)2-△△CT計(jì)算。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞種于6孔板中藥物處理48 h后，加入細(xì)胞裂解液，通過(guò)BCA法測(cè)蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗脫，二抗室溫孵育1 h，再次洗脫并顯影。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度AAs對(duì)TM3細(xì)胞活力的影響 見(jiàn)表1。不同濃度的AAs(2.5、10、25、100、400、1000 μmol/L)與對(duì)照組相比，小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3的活力受到一定的抑制，顯示不同濃度的AAs處理TM3細(xì)胞24 h后對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，當(dāng)濃度高于400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力受到抑制；顯示不同濃度的AAs處理細(xì)胞48、72 h后，TM3細(xì)胞活力受到明顯抑制，且隨著AAs濃度的升高，細(xì)胞活力受抑制越明顯(P<0.05)。最終篩選出3個(gè)合適的濃度：25、100、400 μmol/L。細(xì)胞處理時(shí)間為48 h。

表1 不同濃度AAs對(duì)TM3細(xì)胞活力的影響(%)

2.2 TUNEL法檢測(cè)AAs對(duì)TM3細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染料可與DNA結(jié)合發(fā)綠色熒光，綠色熒光越多表明凋亡細(xì)胞越多。與對(duì)照組相比，25 μmol/L的AAs作用細(xì)胞48 h后細(xì)胞無(wú)明顯變化，當(dāng)100 μmol/L的AAs作用細(xì)胞48 h后，可見(jiàn)明顯的凋亡細(xì)胞，隨著濃度升高，凋亡細(xì)胞增多(圖1)。

圖1 不同濃度AAs對(duì)TM3細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL法，×200)

2.3 qRT-PCR檢測(cè)AAs對(duì)TM3細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的影響 見(jiàn)表2。結(jié)果表明，不同濃度的AAs(25、100、400 μmol/L)處理細(xì)胞48 h后，Caspase-3轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)升高，Caspase-9轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)升高，Bax轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)也升高(P<0.05)。

表2 不同濃度AAs對(duì)TM3細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.4 Western blot 檢測(cè)馬兜鈴酸對(duì)TM3細(xì)胞蛋白水平的影響 結(jié)果表明:不同濃度的AAs處理細(xì)胞48 h后，Caspase-3蛋白水平表達(dá)升高，Caspase-9蛋白水平表達(dá)升高，Bax蛋白水平表達(dá)升高(圖2)。

圖2 不同濃度AAs對(duì)Caspase-3、Caspase-9及Bax蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

含有馬兜鈴酸的中藥有祛風(fēng)散寒藥、止咳平喘藥、利尿通淋藥等，應(yīng)用于多種疾病的治療?！吨袊?guó)藥典》中地方藥材富含馬兜鈴酸屬植物有二十余種。47種口服劑型的中藥可查詢(xún)到馬兜鈴屬植物類(lèi)藥。近年來(lái)含AAs成分的中草藥引起腎臟損害受到廣泛的研究關(guān)注。利用AAs刺激人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)AAs可使線(xiàn)粒體膜通透性改變，造成線(xiàn)粒體腫脹、破壞[9]。實(shí)驗(yàn)室研究證明，AAs能夠損傷腎小血管壁，造成腎小管管壁出現(xiàn)增生、增厚以及管腔狹窄等情況，引發(fā)一定程度的缺血缺氧[10]。亦有少數(shù)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞免疫機(jī)制可能參與馬兜鈴酸腎病(Ari-stolochic acid nephropathy，AAN)間質(zhì)纖維化的形成[11]。此外，有研究顯示，P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是AAN相關(guān)膀胱上皮癌的細(xì)胞周期標(biāo)記，能夠促進(jìn)急性AAN的腎損傷[12]。本實(shí)驗(yàn)以小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系TM3為研究對(duì)象，應(yīng)用CCK-8法驗(yàn)證了不同濃度的AAs可以引起小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力受到不同程度的抑制，且隨著AAs濃度的升高其抑制作用增強(qiáng)。細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) 的催化下加上異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的dUTP，從而可以通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察到帶有綠色熒光。本研究通過(guò)TUNEL染色觀(guān)察到AAs可以引起小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，且凋亡細(xì)胞比例隨著濃度的升高而增高。這提示在體外條件下細(xì)胞凋亡在A(yíng)As所致小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞損傷中占有重要地位。

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的，目前研究比較多的有：Bcl-2家族、P53基因、Ras家族等。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中起著重要作用[13]。Bax在Bcl-2家族起著促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Bax能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，在傳遞過(guò)程中細(xì)胞色素C可以激活上游的Caspase-9，從而使Caspase-3發(fā)生活化[14]。有文獻(xiàn)研究表明AAs產(chǎn)生腎損傷過(guò)程中存在Caspase-3的激活，并在凋亡機(jī)制中扮演重要的角色[15-16]。研究表明AAs可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。過(guò)表達(dá)Bcl-2對(duì)AAs引起的毒副作用具有保護(hù)機(jī)制[18]。AAs通過(guò)ERK 1/2途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生自噬最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。我們通過(guò)qRT-PCR及Western blot等方法探討了AAs對(duì)TM3細(xì)胞凋亡的機(jī)制，結(jié)果表明，不同劑量的AAs可使Caspase-3、Caspase-9、Bax轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平表達(dá)均升高。較高濃度的AAs誘導(dǎo)TM3細(xì)胞發(fā)生凋亡，作用隨濃度增強(qiáng)增強(qiáng)。在低濃度(25 μmol/L)作用72 h后，我們沒(méi)有觀(guān)察到細(xì)胞凋亡發(fā)生，Caspase-3、Caspase-9、Bax無(wú)論蛋白水平還是轉(zhuǎn)錄水平均未發(fā)生明顯變化。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他學(xué)者研究結(jié)果均表明，AAs可以引起小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡[20]。

綜上所述，在體外條件下，一定濃度的AAs可明顯抑制TM3細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)基因及蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax的檢測(cè)，我們認(rèn)為AAs可能是通過(guò)Caspase途徑促進(jìn)TM3細(xì)胞的凋亡來(lái)影響生殖細(xì)胞的發(fā)育。