袁 媛，王彩霞，熊菲菲，雷 蕾，吳小艷，賈福懷

（寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江寧波 315012）

膠原蛋白是一種廣泛分布在各類動物的皮膚、骨骼中的蛋白質(zhì)，一般呈纖維狀，分子量較大，主要分布在細胞外基質(zhì)中[1-2]。Ⅰ型膠原蛋白是組織中分布較廣泛的膠原蛋白，主要存在于脊椎動物的結(jié)締組織中[3]。斑馬魚肌肉和皮膚中膠原蛋白的主要成分是Ⅰ型膠原蛋白，魚類的蛋白肽鏈包含2個α1和一個α2鏈，分別由COL1A1A，COL1A1B和COL1A2所編碼[4]。膠原蛋白肽是膠原蛋白經(jīng)過酶解使其分子鏈解體、斷裂得到的一種產(chǎn)品，由2個或2個以上的氨基酸組成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)片段，其分子量為300 Da左右，分子量較小，易于吸收[5]。研究表明，膠原蛋白肽具有抗氧化性、美白護膚、保護肝臟等多種功效[6-8]。通過探究膠原蛋白肽飲品對斑馬魚膠原蛋白基因表達的影響，為生物體內(nèi)膠原蛋白的生成促進關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗所使用的動物為野生型AB系斑馬魚，年齡為受精后5 d（5 dp）f。

養(yǎng)魚水質(zhì)：28℃下將200 mg速溶海鹽加入1 L反滲透水，電導(dǎo)率為480~510μS/cm，pH值為6.9~7.2，硬度為53.7~71.6 mg/L CaCO3。

1.2 材料與試劑

膠原蛋白肽飲品（由膠原蛋白肽、果汁等組成），自制；1725121，iTaq Universal SYBR Green Supermix，Bio-rad公司提供；pr1701，2×Taq Master Mix，北京百泰克公司提供；1382739，TRI reagent，Invitrogen公司提供；T130144氯仿、E111963無水乙醇，阿拉丁公司提供；FastQuant RT Kit（With gDN-ase） 試劑盒（KR106天根）；A507048異丙醇，上海生工公司提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 膠原蛋白肽飲品最大檢測質(zhì)量濃度（MTC）測定

隨機選取180尾5 dpf（受精后5 d） 野生型AB品系斑馬魚，放置在六孔板（容量3 mL），每孔中30尾斑馬魚。給予膠原蛋白肽飲品不同質(zhì)量濃度，分別為6.25，12.50，25.00，50.00，100.00μL/mL，同時設(shè)置正常對照組。試驗24 h后，觀察記錄斑馬魚的表型和死亡情況，確定膠原蛋白肽飲品對正常斑馬魚的MTC。

1.3.2 評價膠原蛋白肽飲品對膠原蛋白基因表達的影響

根據(jù)質(zhì)量濃度摸索試驗，膠原蛋白肽飲品對斑馬魚的MTC，設(shè)置3個劑量的試驗質(zhì)量濃度。隨機選取120尾5 dpf（受精后5 d） 野生型AB系斑馬魚，放置在六孔板中，每個試驗孔中30尾斑馬魚，分別給予不同劑量膠原蛋白肽飲品3 mL，劑量分別2.8，8.3，25.0μL/mL，同時設(shè)置正常對照組。各組經(jīng)膠原蛋白肽飲品處理1 d后，使用Trizol法提取各試驗組斑馬魚總RNA，然后對總RNA質(zhì)量濃度和純度進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果評定

取斑馬魚樣品的總RNA，精確稱量2μg，合成20μL cDNA置于-20℃下保存?；虮磉_的內(nèi)參為β-actin，將3種Ⅰ型膠原基因COLLA1A，COL1A1B和COL1A2的RNA相對表達量。通過下面公式進行計算：

用方差分析和Dunnett's T-檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，p<0.05表明具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白肽飲品最大檢測質(zhì)量濃度（MTC）測定

膠原蛋白肽飲品處理后“質(zhì)量濃度-致死性”結(jié)果見表1。

表1 膠原蛋白肽飲品處理后“質(zhì)量濃度-致死性”結(jié)果 （n=30）

膠原蛋白肽飲品在6.25，12.50，25.00μL/mL質(zhì)量濃度時，未引起斑馬魚死亡，也沒有產(chǎn)生明顯的毒副作用。在50和100μL/mL質(zhì)量濃度時，分別誘發(fā)47%（14/30尾） 和100%（30/30尾） 斑馬魚死亡。故確定膠原蛋白肽飲品對正常斑馬魚的MTC為25μL/mL。

2.2 RNA提取結(jié)果及引物序列信息

膠原蛋白肽飲品處理斑馬魚結(jié)束后，提取總RNA，測定RNA的質(zhì)量濃度和A260/A280比值，A260/A280比值的結(jié)果均為1.80~2.20，表明提取的斑馬魚總RNA質(zhì)量符合要求，q-PCR試驗可以進行。

總RNA的質(zhì)量濃度見表2，引物序列信息見表3。

表2 總RNA的質(zhì)量濃度/μL·mL-1

表3 引物序列信息

2.3 膠原蛋白肽飲品對斑馬魚COL1A1A，COL1A1B和COL1A2基因表達的影響

根據(jù)基因相對表達量公式計算，膠原蛋白肽飲品不同質(zhì)量濃度組分別為2.8，8.3和25.0μL/mL，其COL1A1A相對表達量分別為1.08，1.38和0.95，與正常對照組相比較，2.8和25.0μL/mL質(zhì)量濃度組均p>0.05，8.3μL/mL質(zhì)量濃度組p<0.05，提示膠原蛋白肽飲品在8.3μL/mL濃度條件下能促進COL1A1A基因的表達，在2.8和25.0μL/mL質(zhì)量濃度條件下，對COL1A1A基因的表達均無明顯作用。

膠原蛋白肽飲品不同質(zhì)量濃度組2.8，8.3，25.0μL/mL，其COL1A1B相對表達量分別為0.85，1.48，0.78，與正常對照組相比較，2.8和25.0μL/mL質(zhì)量濃度組均p>0.05，8.3μL/mL質(zhì)量濃度組p<0.01，提示膠原蛋白肽飲品在8.3μL/mL質(zhì)量濃度條件下能促進COL1A1B基因的表達，在2.8和25μL/mL質(zhì)量濃度條件下，對COL1A1B基因表達無明顯作用。

膠原蛋白肽飲品不同質(zhì)量濃度組2.8，8.3，25μL/mL，其COL1A2相對表達量分別為0.99，1.44，1.03，與正常對照組相較，2.8和25μL/mL質(zhì)量濃度組均p>0.05，8.3μL/mL質(zhì)量濃度組p<0.05，提示膠原蛋白肽飲品在8.3μL/mL質(zhì)量濃度條件下能促進COL1A2基因的表達，在2.8和25μL/mL質(zhì)量濃度條件下，對COL1A2基因的表達無明顯作用。

膠原蛋白肽飲品對斑馬魚COL1A1A，COL1A1B和COL1A2基因表達影響見表4。

表4 膠原蛋白肽飲品對斑馬魚COLA1A，COL1A1B和COL1A2基因表達影響

3 結(jié)論

斑馬魚（Danio rerio）是生長在印度淡水中的熱帶魚，也存在于巴基斯坦淡水河流中，繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、養(yǎng)殖方便。在基因同源性方面，斑馬魚與人類有80%以上，因此斑馬魚可用于人類機體功能的研究[9-11]。試驗通過斑馬魚模型最大檢測質(zhì)量濃度（MTC） 試驗后，設(shè)置低、中、高3個劑量組，分別為2.8，8.3，25.0μL/mL，研究結(jié)果表明膠原蛋白肽飲品在8.3μL/mL質(zhì)量濃度條件下能明顯促進膠原蛋白編碼基因COL1A1A，COL1A1B，COL1A2的表達。

COL1A1A，COL1A1B，COL1A2為編碼I型膠原蛋白的基因，用來分析膠原蛋白合成的重要方法[12-13]。膠原蛋白也是皮膚的主要成分，宋曉婧等人[14]研究發(fā)現(xiàn)，慢性光損傷者的COL1A1A，COL1A1B，COL1A2表達明顯低于未照射組。研究結(jié)果表明，膠原蛋白肽飲品能促進膠原蛋白基因的表達，為膠原蛋白肽類產(chǎn)品的研究提供依據(jù)。