薛永萍 ，肖春橋 ，張琰圖 ，池汝安

（1.武漢工程大學 興發(fā)礦業(yè)學院，武漢 430073；2.武漢工程大學 郵電與信息工程學院，武漢 430073；3.武漢工程大學 環(huán)境與生物工程學院，武漢 430073；4.延安大學 化學與化工學院，陜西 延安 716000）

農作物的生長離不開氮、磷、鉀等微量元素，其中鉀元素對植物的生長起著至關重要的作用[1]。我國土壤中可溶性鉀含量極其貧乏，僅占世界鉀總儲量的0.4%。由于我國是農業(yè)大國，鉀肥消耗量大，每年鉀肥進口量占總用量的60%左右[2]。雖然我國可溶性鉀資源嚴重匱乏，但富含難溶性鉀的硅酸鹽礦物資源如鉀長石礦物卻極為豐富且分布廣泛[3]。已有研究表明，采用物理法和化學法均可高效地從鉀長石礦物中提取難溶性鉀，但大量化肥的使用嚴重破壞了土壤結構，造成了環(huán)境污染[4]。因此，眾多科學家將研究熱點轉移至利用微生物法提取難溶性礦物中的有效元素，以實現低能耗、無污染和資源的循環(huán)利用。

硅酸鹽細菌具有一定的解鉀能力，例如根瘤菌屬（Sinorhizobium sp.）、固氮菌屬（Azotobacter sp.）、芽胞桿菌屬（Bacillus sp.）、微桿菌屬（Microbacterium sp.）、假單孢菌屬（Pseudomonas sp.）等[5]。張成省等[6]在煙草根系土壤中篩選得到27 株具有一定解鉀能力的菌株，其中被鑒定為克雷伯菌屬（Klebsiella sp.）的優(yōu)勢菌解鉀活性為4.4 mg/L。該菌株可促進煙草的生長，利用菌液處理煙株20 d 后，煙株明顯增高，煙葉亦顯著增大。楊柳等[7]從菜園土壤中篩選分離得到一株具有解鉀功能的菌YJ09，被鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），主要靠代謝所產生的多糖分解鉀長石，解鉀能力為2.42 mg/L。Panda 等[8]從印度鹽場分離得到一株土壤不動桿菌，該菌以廉價的葡萄糖、果糖為碳源，在 37 ℃、pH 值為 6.5 的條件下培養(yǎng) 120 h，發(fā)酵液中可溶性鉀可達68 mg/L。

目前，見諸報道的解鉀菌大多數是從農作物根系土壤篩選而得，最為常見的有大豆、小麥和土豆等[8-10]；同時，也可從蘋果樹、茶樹、梨樹、棗樹周圍土壤以及煙草根系土壤中分離篩選獲得。但是，以礦區(qū)土壤為來源分離解鉀菌的報道較少。究其原因，可能是礦區(qū)土壤較貧瘠，微生物含量較少導致難以分離篩選所需微生物。然而，自然界中微生物都有其賴以生存的環(huán)境，如果能從礦區(qū)土壤中篩選得到硅酸鹽菌，則該菌不僅生命力強，且對鉀礦環(huán)境適應能力也強。鑒于此，為利用微生物法分解鉀長石，制備環(huán)境友好型生物有機肥，并應用于農業(yè)生產，提高土壤有機質，實現生態(tài)友好型農業(yè)，本文從湖北省隨州市某鉀長石礦區(qū)土壤中分離篩選具有解鉀功能的菌，并對其解鉀過程進行探討，以期將存在于鉀長石中的緩效鉀和難效鉀轉化為速效鉀，從而解決我國土壤缺鉀的瓶頸問題。

1 實驗部分

1.1 原料與設備

所用原料：土壤，采集自湖北省隨州市某鉀長石礦區(qū)油菜根系土壤；鉀長石，隨州市某鉀長石礦區(qū)提供，經粉碎過篩，依次用去離子水、3 mol/L 鹽酸分別浸泡24、72 h，以去除礦粉中的可溶性離子，最后用去離子水清洗3~5 次，至pH 呈中性，烘干保存?zhèn)溆肹11]；基礎培養(yǎng)基，由葡萄糖10 g、磷酸氫二鉀0.2 g、氯化鈉0.2 g、硫酸鎂 0.2 g、硫酸亞鐵 0.002 g、硫酸錳 0.2 g、氯化鈣0.2 g、硫酸銨0.4 g、二次蒸餾水1 000 mL 配制而成，pH 值為7.0~8.0；解鉀培養(yǎng)基，將基礎培養(yǎng)基中的磷酸氫二鉀0.2 g 改為鉀長石礦粉2 g，其他試劑不變，配制而成，pH 值為7.0~8.0。

所用設備：ML51 型光學顯微鏡，廣州市明美光電技術有限公司產品；JSM5510LV 型掃描電子顯微鏡，日本株式會社產品；50529v1.26 型原子吸收光譜儀，上海圣科儀器設備有限公司產品；PF-16R 型高速離心機，湖南來科技有限公司產品；VS-1300L-U 型無菌凈化工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；YXQ-30SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司產品；S210 型pH 酸度計，梅特勒-托利多儀器有限公司產品；UP-850 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海優(yōu)普實業(yè)有限公司產品。

1.2 解鉀菌的分離、篩選及鑒定

在菌株的分離、篩選和分解礦物過程中，所用培養(yǎng)基必須經過滅菌方可使用。將配置好的培養(yǎng)基分裝于三角瓶，密封后放入立式壓力蒸汽滅菌器，于121 ℃滅菌20 min，待冷卻后取出備用[12]。

（1）多次富集培養(yǎng)：準確稱取油菜根系土壤100 g，加入1 000 mL 無菌水，攪拌均勻后用紗布過濾。用移液管準確吸取5 mL 土壤懸液，加入裝有5 mL 基礎培養(yǎng)基的三角瓶中，放入恒溫搖床，于170 r/min、30 ℃下第1 次富集培養(yǎng)2 d；從第1 次富集培養(yǎng)液中再次吸取5 mL 的發(fā)酵液，且減少培養(yǎng)基中磷酸氫二鉀的用量，同等條件下培養(yǎng)2 d，即為第2 次富集培養(yǎng)；按相同方法，進行多次富集培養(yǎng)，直至溶液澄清。在此過程中切記務必將磷酸氫二鉀的用量依次減少，以提高微生物在解鉀培養(yǎng)基上的適應能力。

（2）菌種分離純化：用移液槍吸取200 μL 經多次富集后的澄清菌液，均勻涂布于平板解鉀培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內倒置培養(yǎng)。觀察菌落形態(tài)及解鉀能力，并多次進行菌落的分離純化。將不同形態(tài)的單菌落斜面培養(yǎng)，于4 ℃保藏[12]。

（3）基因測序鑒定：對篩選得到的具有解鉀能力的菌株，通過顯微鏡觀測其形態(tài)，并進行生理生化特性分析，由上海美吉生物有限公司進行基因測序鑒定。測序引物分別為SN1：5′-CCAACCTGGTTGATcc-TGCCAGTA-3′，SN2：5′-CCTTGTTACGACTTCACCTT-CCTCT-3'。經與NT 數據庫比對，鑒定其種屬。

1.3 微生物菌株溶解鉀礦實驗

對已分離、篩選、鑒定且具有較高解鉀能力的菌株進行溶礦實驗。首先配置解鉀液體培養(yǎng)基，調節(jié)pH值為6.0~8.0（不同微生物取值不同）。量取60 mL 培養(yǎng)基分裝于250 mL 三角瓶，按設定實驗要求分別加入一定量的鉀長石礦粉作為唯一鉀源，于121 ℃滅菌20 min。在無菌凈化操作臺中，將已活化制備的菌懸浮液按一定體積比接入三角瓶，置于恒溫振動搖床上，以不同培養(yǎng)溫度、轉速和時間條件下發(fā)酵培養(yǎng)。每2 d取樣測定發(fā)酵液中的可溶性鉀含量及其pH 值。每組平行實驗3 次，且以不接種為對照組。發(fā)酵液經普通漏斗過濾，分別收集濾渣和濾液。將濾渣經洗滌、烘干后對其進行掃描電鏡（SEM）分析。而濾液則依次置入臺式高速離心機，9 000 r/min 離心 30 min，0.45 μm 微孔膜過濾2 次，最后采用原子吸收法測定溶液中的有效鉀含量。采用單因素法，探討培養(yǎng)時間、溫度及轉速等因素對解鉀菌的生長和解鉀能力的影響，以優(yōu)化解鉀工藝。

2 結果與分析

2.1 解鉀菌的分離篩選及鑒定

通過大量實驗，從礦區(qū)土樣中篩選得到了4 株具有解鉀功能的真菌，其中命名為JX-14 的真菌為一新型解鉀真菌。該菌平板菌落形態(tài)和顯微鏡壓片所得照片如圖1 所示。

圖1 JX-14 菌的菌落形態(tài)和顯微照片Fig.1 Colony morphology and microscopic observation of JX-14 strain

由圖1 可知，JX-14 菌株為一藍色真菌，其菌絲相互交錯，較細且無分隔。通過基因測序鑒定，該菌系統(tǒng)發(fā)育進化比對結果可知，沒有相似度高的菌株，由此可認為該菌為一新菌。

2.2 JX-14 菌的解鉀工藝優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)時間對解鉀能力的影響

礦物表面經JX-14 菌溶蝕16 d 前后的掃描電鏡照片如圖2 所示。

圖2 經JX-14 菌溶蝕前后鉀長石礦物表面的掃描電鏡圖Fig.2 SEM photos of potassium feldspar before and after decomposed by JX-14 fungus

由圖2 可知，未經菌體溶蝕的鉀長石礦物表面棱角清晰，當培養(yǎng)16 d 后，礦粉表面出現明顯坑洞，些許棱角亦被磨平。這一現象表明礦物結構被破壞，晶格被破壞致使其中的鉀離子得以釋放。

在培養(yǎng)溫度為40 ℃、轉速為170 r/min、培養(yǎng)基pH值為7.0~8.0、鉀長石質量濃度為2 g/L 且粒度為0.03~0.04 mm、接種體積分數為30%、硫酸銨質量濃度為0.4 g/L 的條件下，考察培養(yǎng)時間對JX-14 真菌解鉀能力的影響，結果如圖3 所示。

圖3 培養(yǎng)時間對溶液中可溶性鉀離子含量的影響Fig.3 Effect of culture times on content of soluble potassium in solution

由圖3 可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，溶液中可溶性鉀離子含量先快速增加后趨于不變。當培養(yǎng)時間超過16 d 時，鉀離子質量濃度變化很小，可達25.28 mg/L，其浸出率為9.06%。分析原因，有機酸的分泌量隨著碳源的減少而減少，從而降低了細菌的解鉀能力[13-15]。

2.2.2 培養(yǎng)溫度對解鉀能力的影響

在轉速為170 r/min、培養(yǎng)基pH 值為7.0~8.0、鉀長石質量濃度為2 g/L 且粒度為0.03~0.04 mm、接種體積分數為30%、硫酸銨質量濃度為0.4 g/L 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)16 d，考察培養(yǎng)溫度對JX-14 解鉀能力的影響，結果如圖4 所示。

由圖4 可知，隨著培養(yǎng)溫度的增加，溶液中可溶性鉀離子含量先增加后減少，最適宜培養(yǎng)溫度為40 ℃。由此可見，該菌極耐高溫。此時溶液中鉀離子質量濃度為26.01 mg/L，浸出率高達9.32%。究其原因，溫度過高或過低均不利于微生物的生長和繁殖，使其分泌有機酸的量減少，從而降低了菌體分解礦物的能力[16-18]。

圖4 培養(yǎng)溫度對溶液中可溶性鉀離子含量的影響Fig.4 Effect of cultivation temperature on content of soluble potassium in solution

2.2.3 培養(yǎng)轉速對解鉀能力的影響

在溫度為40 ℃、培養(yǎng)基pH 值為7.0~8.0、鉀長石質量濃度為2 g/L 且粒度0.03~0.04 mm、接種體積分數為30%、硫酸銨質量濃度為0.4 g/L 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)16 d，探討培養(yǎng)轉速對JX-14 解鉀能力的影響，結果如圖5 所示。

圖5 培養(yǎng)轉速對溶液中可溶性鉀離子含量的影響Fig.5 Effect of shaking speed during cultivation on content of soluble potassium in solution

由圖5 可知，隨著培養(yǎng)轉速的增加，溶液中可溶性鉀離子含量先快速增加后下降。當轉速達170 r/min時，溶液中鉀離子質量濃度最大，為25.84 mg/L，此時浸出率為9.26%，明顯高于靜止培養(yǎng)時溶液中的鉀離子含量。究其原因，轉速較高會產生較大的剪切力，一方面降低了微生物的數量，另一方面也不利于微生物和礦粉接觸，使其解鉀能力下降；而轉速過低，則沒有足夠的氧容量維持細菌的生長和繁殖，其解鉀能力也下降[19]。

2.2.4 培養(yǎng)基初始pH 值對解鉀能力的影響

在溫度為40 ℃、轉速為170 r/min、鉀長石質量濃度為2 g/L 且粒度為0.03~0.04 mm、接種體積分數為30%、硫酸銨質量濃度為0.4 g/L 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)16 d，考察培養(yǎng)基初始pH 值對JX-14 真菌解鉀能力的影響，結果如圖6 所示。

圖6 培養(yǎng)基初始pH 值對溶液中可溶性鉀離子含量的影響Fig.6 Effect of pH value of culture medium on content of soluble potassium in solution

由圖6 可知，隨著培養(yǎng)基初始pH 值的增加，溶液中可溶性鉀離子含量先增加后下降。pH 值為7.0~8.0時，溶液中鉀離子質量濃度較大，為25.33~24.72 mg/L，浸出率可達9.08%~8.86%。究其原因，和溫度一樣，過高或過低的pH 值都不利于微生物的生長和繁殖，致其解鉀能力下降[20]。

2.2.5 鉀長石礦粉濃度對解鉀能力的影響

在溫度為40 ℃、轉速170 r/min、培養(yǎng)基pH 值為7.0~8.0、鉀長石粒度0.03~0.04 mm、接種體積分數為30%、硫酸銨質量濃度為0.4 g/L 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)16 d，分析礦粉濃度對浸出率的影響，結果如圖7 所示。

圖7 礦粉濃度對溶液中可溶性鉀離子浸出率的影響Fig.7 Effect of K-feldspar concentration on corrosion efficiency of soluble potassium in solution

由圖7 可知，隨著礦粉濃度的增加，溶液中可溶性鉀離子含量先緩慢增加后極速下降。當礦粉質量濃度為2 g/L 時，浸出率可高達9.28%。分析其原因，隨著礦粉濃度的增加，沒有足夠多的微生物來溶解鉀長石以釋放鉀。

2.2.6 鉀長石礦粉粒度對解鉀能力的影響

在溫度為40 ℃、轉速為170 r/min、培養(yǎng)基pH 值為7.0~8.0、鉀長石質量濃度為2 g/L、接種量為30%、硫酸銨質量濃度為0.4 g/L 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)16 d，考察礦粉粒度對溶液中可溶性鉀離子含量的影響，如圖8 所示。

圖8 礦粉粒度對溶液中可溶性鉀離子含量的影響Fig.8 Effect of K-feldspar granularity on content of soluble potassium in solution

由圖8 可知，隨著礦粉粒度的增加，鉀離子含量先增加后下降。當粒徑為0.03~0.04 mm 時，溶液中可溶性鉀離子質量濃度可達25.89~25.03 mg/L，浸出率為9.28%~8.97%。分析其原因，礦粉粒徑越小，與培養(yǎng)液中的菌體接觸則越頻繁，更有利于微生物破壞礦物結構，以釋放更多的鉀離子。但是當礦物粒徑小于0.03 mm 時，礦物顆粒間易發(fā)生團聚現象，使其顆粒粒徑增大，減小了礦粉與溶液中菌體的接觸面，從而導致鉀離子難以釋放。

2.2.7 接種量對解鉀能力的影響

在溫度為40 ℃、轉速為170 r/min、培養(yǎng)基pH 值為7.0~8.0、鉀長石質量濃度為2 g/L 且粒度為0.03~0.04 mm、硫酸銨質量濃度為0.4 g/L 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)16 d，探討接種量對溶液中可溶性鉀離子含量的影響，結果如圖9 所示。

圖9 接種量對溶液中可溶性鉀離子含量的影響Fig.9 Effect of inoculation volume on content of soluble potassium in solution

由圖9 可知，當菌液接種體積分數小于25%時，溶液中可溶性鉀離子含量隨接種量的增加而快速增加。當接種體積分數超過25%時，溶液中可溶性鉀離子含量變化不明顯，其最優(yōu)接種體積分數為30%，鉀離子質量濃度可達25.61 mg/L，浸出率為9.18%。究其原因，菌液濃度過低時，沒有足夠量的微生物分解鉀長石以破壞其晶體結構，進而釋放鉀離子。

2.2.8 氮源及其濃度對解鉀能力的影響

在溫度為40 ℃、轉速為170 r/min、培養(yǎng)基pH 值為7.0~8.0、鉀長石質量濃度為2 g/L 且粒度為0.03~0.04 mm、接種體積分數為30%、硫酸銨質量濃度為0.4 g/L 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)16 d，考察不同氮源對溶液中可溶性鉀離子含量的影響，結果如圖10 所示。

圖10 氮源對溶液中可溶性鉀離子含量的影響Fig.10 Effect of nitrogen source on content of soluble potassium in solution

由圖10 可知，氮源對溶液中鉀離子含量也有一定影響。同等條件下硫酸銨為最佳氮源，此時，鉀離子質量濃度為25.97 mg/L，浸出率為9.31%。由此表明，硫酸銨的加入能夠促進微生物的生長和繁殖，更有利于釋放鉀離子。

同等條件下考察不同硫酸銨質量濃度對溶液中可溶性鉀離子含量的影響，結果如圖11 所示。

圖11 硫酸銨濃度對溶液中可溶性鉀離子含量的影響Fig.11 Effect of ammonium sulfate dose on content of soluble potassium in solution

由圖11 可知，隨著硫酸銨質量濃度的增加，溶液中可溶性鉀離子的含量先增加后減少。當硫酸銨質量濃度為0.4 g/L 時，鉀離子質量濃度最高為25.96 mg/L，浸出率為9.32%；而不加硫酸銨進行對照實驗，溶液中可溶性鉀離子質量濃度僅為11.08 mg/L，浸出率為3.77%。由此可見，加入硫酸銨明顯提高了菌分解礦物的能力。究其原因，無機氮的加入，不僅能促進細菌的生長，也有利于細菌產生更多的有機酸[21-23]。但當硫酸銨濃度過高時，則和培養(yǎng)基中的鈣、鎂等離子形成沉淀，降低了微生物賴以生長和繁殖的微量元素，使其解鉀能力下降。

2.2.9 碳源對解鉀能力的影響

在溫度為40 ℃、轉速為170 r/min、培養(yǎng)基pH 值為7.0~8.0、鉀長石質量濃度為2 g/L 且粒度為0.03~0.04 mm、接種體積分數為30%、硫酸銨質量濃度為0.4 g/L 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)16 d，考察碳源對溶液中可溶性鉀離子含量的影響，結果如圖12 所示。

圖12 碳源對溶液中可溶性鉀離子含量的影響Fig.12 Effect of carbon source on content of soluble potassium in solution

由圖12 可知，碳源對溶液中鉀離子含量有一定的影響，同等條件下葡萄糖為最佳碳源，此時，鉀離子質量濃度為25.84 mg/L，浸出率為9.26%。

2.3 JX-14 菌解鉀優(yōu)勢分析

為驗證最優(yōu)工藝條件下該菌株分解鉀礦的能力，再次將該菌株與篩選得到的另一菌株JX-10 細菌類微生物在一定培養(yǎng)溫度和不同接種量條件下對鉀長石礦粉進行溶蝕，對比兩菌株溶解鉀礦的能力，結果如圖13—圖14 所示。

由圖13 可以看出，在不同培養(yǎng)溫度下兩菌株分解鉀礦浸出率都隨培養(yǎng)時間的增加先快速達到其最大值，其后基本維持不變。對比JX-14 和JX-10 兩菌株分解鉀礦的能力，當兩菌株在各自最優(yōu)化培養(yǎng)溫度40 ℃和36 ℃時，鉀浸出率最高，依次為9.36%和8.36%。由圖14 可知，當接種體積分數分別為30%和25%時，鉀浸出率最高，為9.16%和8.22%。由此可見，在最優(yōu)工藝條件下JX-14 菌株分解礦物能力高于JX-10 菌株。這一結果不僅說明JX-14 菌株解鉀能力較強，同時也進一步說明解鉀類微生物種類不局限于細菌類，真菌類微生物也具有較強的分解鉀礦能力，且耐高溫，更宜于高溫條件下利用微生物分解實際礦物。此外，也為后續(xù)研究微生物分解礦物熱、動力學奠定了基礎。因此，可以說本文篩選得到的JX-14 菌株為一種可有效分解鉀礦的新菌。

圖13 不同溫度條件下JX-14 真菌和JX-10 細菌的解鉀能力對比Fig.13 Comparison of potassium releasing ability between JX-14 fungus and JX-10 bacterium under different temperatures

圖14 不同接種體積分數條件下JX-14 真菌和JX-10細菌的解鉀能力對比Fig.14 Comparison of potassium releasing ability between JX-14 fungus and JX-10 bacterium under different inoculation volume fractions

3 結 論

從湖北省隨州市鉀長石礦區(qū)土壤中分離出的JX-14 菌株可以有效地溶解鉀長石礦物，以釋放其中的難溶性鉀，研究結果表明：

（1）該菌株為一新型耐高溫解鉀真菌，其最優(yōu)解鉀工藝為溫度40 ℃、轉速170 r/min、培養(yǎng)基pH 值7.0~8.0、鉀長石質量濃度2 g/L 且粒度0.03~0.04 mm、接種體積分數30%、硫酸銨質量濃度為0.4 g/L 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)16 d 后，溶液中可溶性鉀離子質量濃度可達26.12 mg/L，浸出率為9.36%。

（2）隨著培養(yǎng)溫度、轉速、培養(yǎng)基pH 值、鉀長石質量濃度及粒度、接種量、硫酸銨質量濃度的增加，JX-14 菌株分解鉀礦的浸出率先增加后減小，隨著培養(yǎng)時間的增加先迅速增加，其后維持不變。

（3）本文研究成果可為微生物有機肥的制備提供一定的理論依據和技術指導，為推進以提高土壤有機質為核心任務的“沃土工程”添磚加瓦，為實現農業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定基礎，最終實現土壤安全、糧食安全、食品安全與生態(tài)安全。