蓋守娟

(朝陽市第二醫(yī)院消化內科，遼寧 朝陽 122000)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是消化道常見惡性腫瘤之一，惡性程度高，預后較差，在癌癥相關的死亡中居第3位[1]。近年來，PC發(fā)病率呈現上升趨勢，PC早期癥狀不典型，許多患者確診時已處于局部進展或遠端轉移階段，錯過了最佳手術時機，導致5 a生存率低于9%[2]。因此，早期診斷、及早治療是改善PC患者預后的關鍵。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A)基因是PC中最常見的體細胞突變基因之一，其突變可能會增加罹患PC的風險，且CDKN2A基因啟動子區(qū)過度甲基化在PC的發(fā)生、發(fā)展中起著至關重要的作用[3-4]。CDKN2A基因的缺失可通過負反饋導致細胞周期蛋白依賴激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)、細胞周期蛋白依賴激酶6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6)活性增加，從而促進細胞周期進程[5-6]。本研究通過觀察CDKN2A基因表達與胰腺癌臨床病理特征的關系，探討CDKN2A在PC發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 組織標本來源選擇2016年1月至2018年6月朝陽市第二醫(yī)院保存的88例PC患者的PC組織標本，其中男52例，女36例；年齡43～73(60.20±9.28)歲，體質量指數18.9～26.3(22.78±3.01) kg·m-2。病例納入標準：(1)經病理學檢查確診為PC；(2)術前未行放射治療、化學治療等抗腫瘤治療；(3)臨床病理資料完整。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)有免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、全身感染性疾病、肝腎功能障礙等其他基礎疾病；(3)失訪者。同時選擇相應正常胰腺組織標本30例作為對照，其中男20例，女10例；年齡45～69(58.22±8.78)歲，體質量指數20.5～26.7(23.04±2.96)kg·m-2。2組患者的性別、年齡、體質量指數比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 反轉錄定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)法檢測PC組織和正常胰腺組織中CDKN2A mRNA的表達PC組織和正常胰腺組織各取100 mg分別置入EP管內，加入TRIzol進行組織溶解，然后加入0.3 mL氯仿，室溫下震蕩30 s，放置30 min，取上清液移入另一EP管，加入等體積的異丙嗪溶液，室溫放置30 min，1 000 r·min-1離心10 min，取沉淀物為RNA，加入體積分數75%乙醇1 mL，溶解后1 000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入20 μL無核酸酶水。采用SuperScript IV反轉錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行cDNA合成，引物合成和設計由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，以β-actin為內參；CDKN2A mRNA上游引物序列為5′-CTTTGAGGTGCGTGTTT-3′，下游引物序列為5′-CAGTGCTCGCTTAGTGC-3′；β-actin上游引物序列為5′-GGATCCTGCGATGTGCA-3′，下游引物序列為5′-GGTCAAAGTCCAGGCT-3′。將RNA模板、引物、dNTP、DTT、RT緩沖液混合，組成20 μL體積的反轉錄體系，根據說明行PCR檢測。采取2-ΔΔCt法計算CDKN2A mRNA的相對表達量。實驗設3組復孔，取均值。

2 結果

2.1 PC組織和正常胰腺組織中CDKN2A mRNA相對表達量比較PC組織和正常胰腺組織中CDKN2A mRNA相對表達量分別為1.43±0.56、2.03±0.87，PC組織中CDKN2A mRNA相對表達量顯著低于正常胰腺組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.531，P<0.05)。

2.2 CDKN2A基因表達與PC臨床病理特征的關系結果見表1。以正常胰腺組織中CDKN2A mRNA相對表達量均值2.03為界值，PC組織中CDKN2A基因高表達者36例，低表達者52例。CDKN2A基因高表達與低表達患者的性別、年齡、腫瘤部位比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CDKN2A基因高表達與低表達患者的腫瘤直徑、組織分化程度和腫瘤臨床分期比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 CDKN2A基因表達與PC患者臨床病理特征的關系

2.3 CDKN2A mRNA表達與PC患者生存率的關系結果見圖1和圖2。CDKN2A mRNA高表達和低表達患者2 a總生存率分別為66.67%(24/36)、34.62%(18/52)，CDKN2A mRNA低表達患者2 a總生存率顯著低于高表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.516，P<0.05)；CDKN2A mRNA高表達和低表達患者2 a疾病無進展生存率分別為58.33%(21/36)、23.08%(12/52)，CDKN2A mRNA低表達患者2 a疾病無進展生存率顯著低于高表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.370，P<0.05)。

圖1 CDKN2A基因表達與PC患者2 a總生存率的關系

圖2 CDKN2A基因表達與PC患者2 a疾病無進展生存率的關系

3 討論

PC的發(fā)病機制尚不完全明確，其發(fā)生與遺傳因素、飲食因素或者基礎性膽道系統(tǒng)疾病等有關[7]。有研究顯示，長期高蛋白、高脂肪飲食的PC患者的預后更差，其帶瘤生存率降低，中位生存時間明顯縮短[8-9]。基因水平改變及癌細胞周期調控基因異?？赡茉赑C發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。CDKN2A基因定位于9號染色體21區(qū)，編碼1個由148個氨基酸組成的蛋白[10]。有研究顯示，CDKN2A基因編碼的蛋白可與CDK4、CDK6結合而抑制細胞周期蛋白與CDK4結合形成具有激酶活性的復合物，阻斷該復合物對成視網膜母細胞瘤蛋白的磷酸化，將細胞阻滯于G1期，從而抑制細胞增殖[11]。研究顯示，CDKN2A基因是一種腫瘤抑制基因，其純合性缺失與雜合性缺失是黑色素瘤發(fā)生的重要機制之一[12]。CDKN2A基因編碼細胞周期抑制劑蛋白p16和p14，在90%～98%的胰腺導管腺癌細胞中由于基因突變或啟動子過度甲基化導致CDKN2A基因丟失[13-14]。本研究結果顯示，PC組織中CDKN2A mRNA相對表達量顯著低于正常胰腺組織，且腫瘤直徑越大、組織分化程度越低、腫瘤臨床分期越高的患者CDKN2A基因表達越低，提示CDKN2A基因低表達可能與PC的發(fā)生與發(fā)展有關，CDKN2A基因可抑制胰腺導管上皮細胞增殖，減弱腫瘤細胞的浸潤能力，但其具體機制仍不明確。

PC發(fā)病隱匿，早期癥狀不典型，多數患者確診時已屬于晚期，預后差，生存期短，5 a生存率低[15]。本研究結果顯示，CDKN2A基因高表達和低表達患者2 a總生存率分別為66.67%(24/36)、34.62%(18/52)，2 a疾病無進展生存率分別為58.33%(21/36)、23.08%(12/52)，CDKN2A基因低表達患者2 a總生存率和2 a疾病無進展生存率顯著低于高表達患者，提示CDKN2A基因表達與PC患者的預后有關。

綜上所述，PC組織中CDKN2A基因表達下調，且CDKN2A基因表達與腫瘤大小、組織分化程度、腫瘤臨床分期及患者生存狀況有一定關系，CDKN2A基因檢測可為PC患者的病情及預后評估提供參考。