許 超，王松田

(1.焦作市人民醫(yī)院眼科，河南 焦作 454000；2.焦作尖峰眼科醫(yī)院屈光科，河南 焦作 454000)

原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是一種不可逆的致盲性眼病，60%～70%的青光眼患者為POAG，其臨床表現(xiàn)主要為視神經(jīng)損傷以及視野缺損，可嚴(yán)重影響患者的視覺功能，使生活質(zhì)量明顯下降[1-3]。POAG患者視覺功能損害的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGC)損傷，有研究顯示眼壓增高與POAG患者視覺功能損傷密切相關(guān)[4]。然而，眼壓增高并非POAG視神經(jīng)損傷發(fā)生的唯一原因，近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)不僅存在于血管內(nèi)皮，還在各類組織及細(xì)胞中廣泛存在，其表達(dá)與POAG發(fā)生及發(fā)展存在潛在關(guān)聯(lián)[5-6]。本研究旨在探討POAG患者視神經(jīng)損傷不同階段血漿ET-1水平的變化，并分析血漿ET-1與外周血巨噬細(xì)胞核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥復(fù)合體、血清炎癥因子水平及眼動(dòng)脈血流的關(guān)系，以期為POAG的病情評(píng)估及臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年2月至2020年2月焦作市人民醫(yī)院眼科收治的POAG視神經(jīng)損傷患者為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合POAG診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，且伴有不同程度的視神經(jīng)損傷；(2)患者病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有眼部手術(shù)史；(2)有化學(xué)治療、放射治療及免疫治療史；(3)合并精神系統(tǒng)疾病或意識(shí)障礙；(4)合并肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙；(5)合并血液性、感染性或免疫性疾病。本研究共納入POAG視神經(jīng)損傷患者117例，所有患者進(jìn)行視野的平均缺損(mean defect,MD)程度檢測(cè)，根據(jù)MD值將患者分為輕度損傷組(MD<7 dB，43例)、中度損傷組(7≤MD≤12 dB，35例)和重度損傷組(MD>12 dB，39例)。輕度損傷組43例，男24例，女19例；年齡35～71(51.74±6.86)歲；眼壓20～42(30.05±4.51)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。中度損傷組35例，男17例，女18例；年齡37～65(50.89±6.09)歲；眼壓21～42(29.69±4.42)mm Hg。重度損傷組39例，男18例，女21例；年齡34～73(52.62±8.81)歲；眼壓19～39(30.21±4.69)mm Hg。3組患者的性別、年齡分布及眼壓比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 血漿ET-1水平抽取患者晨起空腹肘靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，3 000 r·min-1離心10 min，取上層血漿，采用放射免疫法檢測(cè)血漿ET-1水平，試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 血清白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18和IL-1β水平抽取患者晨起空腹肘靜脈血5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、IL-1β水平，試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 外周靜脈血巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥復(fù)合體水平抽取患者外周靜脈血5 mL，采用Ficoll密度梯度離心法分離提取白細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，室溫下50 g·L-1多聚甲醛固定30 min，體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清封閉1 h；加入兔抗人NLRP3抗體(美國(guó)Epitomics公司)、凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated speck like protein containing CARD,ASC)(英國(guó)Abcam公司)、兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)抗體(美國(guó)Cell Signalling Technology公司)一抗，4 ℃孵育過夜；次日以含Tween-20的Tris-HCl緩沖液洗滌細(xì)胞3次，室溫下采用抗兔二抗(以PE-texas Red A標(biāo)記)孵育30 min，以含Tween-20的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞3次，雙蒸水重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入流式管，應(yīng)用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)篩選出巨噬細(xì)胞亞群，再進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞表面NLRP3、ASC、caspase-1熒光強(qiáng)度，以actin為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 眼動(dòng)脈血流應(yīng)用彩色多普勒超聲儀(美國(guó)GE公司)測(cè)定患者眼動(dòng)脈收縮期最大流速(peak systolic velocity,PSV)、舒張末期血流速度(end diastolic velocity,EDV)、阻力指數(shù)(resistance index,RI)。

2 結(jié)果

2.1 3組患者血漿ET-1及血清炎癥因子水平比較結(jié)果見表1。3組患者血清IL-2、IL-4、IL-6水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；重度損傷組和中度損傷組患者血漿ET-1及血清IL-18、IL-1β水平顯著高于輕度損傷組，重度損傷組患者血漿ET-1及血清IL-18、IL-1β水平顯著高于中度損傷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重度損傷組和中度損傷組患者血清IL-12水平顯著低于輕度損傷組，重度損傷組患者血清IL-12水平顯著低于中度損傷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組患者血漿ET-1及血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-18、IL-1β水平比較

2.2 3組患者外周血巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥復(fù)合體水平比較結(jié)果見表2。重度損傷組和中度損傷組患者外周血巨噬細(xì)胞中NLRP3、ASC、caspase-1水平顯著高于輕度損傷組，重度損傷組患者外周血巨噬細(xì)胞中NLRP3、ASC、caspase-1水平顯著高于中度損傷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組患者外周血巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥復(fù)合體水平比較

2.3 3組患者眼動(dòng)脈血流情況比較結(jié)果見表3。重度損傷組和中度損傷組患者眼動(dòng)脈PSV、RI顯著高于輕度損傷組，眼動(dòng)脈EDV顯著低于輕度損傷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重度損傷組患者眼動(dòng)脈PSV、RI顯著高于中度損傷組，眼動(dòng)脈EDV顯著低于中度損傷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 3組患者眼動(dòng)脈血流比較

2.4 POAG視神經(jīng)損傷患者血漿ET-1水平與血清炎癥因子、外周血巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥復(fù)合體水平及眼動(dòng)脈血流指標(biāo)的相關(guān)性結(jié)果見表4。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，POAG視神經(jīng)損傷患者血漿ET-1水平與血清IL-18、IL-1β及外周血巨噬細(xì)胞中NLRP3、ASC、caspase-1水平和眼動(dòng)脈PSV、RI呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與眼動(dòng)脈EDV呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而與血清IL-12水平無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表4 POAG視神經(jīng)損傷患者血漿ET-1水平與血清炎癥因子、外周血巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥復(fù)合體水平及眼動(dòng)脈血流指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

目前，POAG患者視神經(jīng)損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，RGC凋亡可能是POAG視神經(jīng)損傷的主要原因[8-9]。眼壓升高是RGC凋亡的危險(xiǎn)因素，然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)，許多患者降眼壓治療后無法有效抑制RGC凋亡，眼壓得到較好控制的POAG患者，其視野仍會(huì)有進(jìn)一步惡化情況出現(xiàn)，因此，眼壓升高并不能合理地解釋POAG的發(fā)病機(jī)制[10-12]。

有調(diào)查顯示，POAG患者自身免疫性疾病發(fā)病率高達(dá)30%，提示免疫反應(yīng)可能在POAG視神經(jīng)損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中承擔(dān)著重要角色[13]。明確POAG發(fā)病機(jī)制中各種通路的相關(guān)調(diào)節(jié)因子功能對(duì)治療POAG患者視神經(jīng)損傷有重要意義。

ET-1是一種長(zhǎng)效縮血管活性肽，半衰期短，短時(shí)間內(nèi)可被ET降解酶分解，其在體內(nèi)可通過與ET受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。ET-1在視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、睫狀體等眼部組織中廣泛存在，其在眼壓、血流及炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)中承擔(dān)著重要作用。 ET-1可促使炎癥介質(zhì)及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α、IL-1等，這些炎癥介質(zhì)可促使白細(xì)胞趨化、聚集、激活，誘導(dǎo)更多的氧自由基脂質(zhì)代謝產(chǎn)物、蛋白溶解酶釋放，造成眼部組織細(xì)胞損傷，使眼部組織細(xì)胞通透性增加，從而導(dǎo)致視神經(jīng)功能損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，重度損傷組和中度損傷組患者血漿ET-1水平顯著高于輕度損傷組，重度損傷組患者血漿ET-1水平顯著高于中度損傷組，提示血漿ET-1水平與POAG患者視神經(jīng)損傷程度有相關(guān)性，檢測(cè)血漿ET-1水平可對(duì)預(yù)測(cè)POAG患者視神經(jīng)損傷程度提供幫助。

NLRP3炎癥復(fù)合體為高分子蛋白復(fù)合物，主要由NLRP3、ASC、casepase-1組成。在血液循環(huán)過程中，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均可表達(dá)NLRP3炎癥復(fù)合體[15]。目前認(rèn)為，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)等受體激活可促進(jìn)NLRP3炎癥復(fù)合體表達(dá)，這是啟動(dòng)細(xì)胞炎癥性死亡的第1信號(hào)途徑[16]。TLR4是先天免疫分子的一種，POAG患者的小梁網(wǎng)或RGC中均可表達(dá)TLR4，TLR4激活可促進(jìn)小梁網(wǎng)纖維化及RGC細(xì)胞死亡，而抑制TLR4能夠降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2誘導(dǎo)的小梁網(wǎng)細(xì)胞纖維化程度，提高RGC存活率[17]。小梁網(wǎng)可調(diào)節(jié)房水外流，在眼壓調(diào)節(jié)過程中扮演著重要角色，ET-1水平升高引起小梁網(wǎng)異常收縮，抑制房水正常外流，導(dǎo)致眼壓升高。本研究結(jié)果顯示，重度損傷組和中度損傷組患者外周血巨噬細(xì)胞中NLRP3、ASC、caspase-1水平顯著高于輕度損傷組，重度損傷組患者外周血巨噬細(xì)胞中NLRP3、ASC、caspase-1水平顯著高于中度損傷組，提示NLRP3炎癥復(fù)合體可能參與POAG視神經(jīng)損傷的過程。Pearson相關(guān)分析顯示，POAG視神經(jīng)損傷患者血漿ET-1水平與外周血巨噬細(xì)胞中NLRP3、ASC、caspase-1水平呈顯著正相關(guān)，提示血漿ET-1水平與外周血巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥復(fù)合體水平密切相關(guān)。

IL-1β主要由先天性免疫細(xì)胞在炎癥損傷中表達(dá)。IL-18屬于IL-1超家族，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，刺激各種細(xì)胞并具有多效性功能。有研究表明，IL-1β、IL-18與NLRP3炎癥復(fù)合體的形成與激活存在緊密聯(lián)系[18]。NLRP3炎癥復(fù)合體可識(shí)別多種病原相關(guān)分子模式與危險(xiǎn)相關(guān)分子模式，其活化后促進(jìn)下游炎癥因子IL-18和IL-1β的成熟與釋放，參與慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、肺結(jié)核、急性肺損傷和肺纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展。 本研究結(jié)果顯示，重度損傷組和中度損傷組患者血清IL-18、IL-1β水平顯著高于輕度損傷組，重度損傷組患者血清IL-18、IL-1β水平顯著高于中度損傷組，且血漿ET-1水平與血清IL-18、IL-1β水平呈顯著正相關(guān)。NLRP3復(fù)合體激活可使下游炎癥因子IL-1β、IL-18水平升高，機(jī)體炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)而影響ET-1水平異常改變，促使白細(xì)胞趨化聚集，誘導(dǎo)氧自由基脂質(zhì)代謝產(chǎn)物增多，蛋白溶解酶釋放，導(dǎo)致眼部組織細(xì)胞損傷，通透性增加，而致視神經(jīng)功能損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，血漿ET-1水平與POAG患者眼血流動(dòng)力學(xué)變化存在緊密聯(lián)系[19]。本研究結(jié)果顯示，重度損傷組和中度損傷組患者眼動(dòng)脈PSV、RI顯著高于輕度損傷組，眼動(dòng)脈EDV顯著低于輕度損傷組；重度損傷組患者眼動(dòng)脈PSV、RI顯著高于中度損傷組，眼動(dòng)脈EDV顯著低于中度損傷組；提示眼動(dòng)脈血流狀態(tài)與POAG患者視神經(jīng)損傷存在關(guān)聯(lián)；進(jìn)一步Pearson相關(guān)分析顯示，POAG視神經(jīng)損傷患者血漿ET-1水平與眼動(dòng)脈PSV、RI呈顯著正相關(guān)，與眼動(dòng)脈EDV呈顯著負(fù)相關(guān)，提示POAG視神經(jīng)損傷患者血漿ET-1水平與眼動(dòng)脈血流狀態(tài)密切相關(guān)，可在一定程度上反映POAG患者的眼動(dòng)脈血流狀態(tài)，從而對(duì)其視神經(jīng)損傷程度進(jìn)行評(píng)估。

綜上所述，POAG患者血漿ET-1水平與視神經(jīng)損傷程度呈顯著正相關(guān)，且與外周血巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥復(fù)合體、炎癥因子及眼動(dòng)脈血流狀態(tài)有相關(guān)性，檢測(cè)血漿ET-1水平可為POAG患者的病情評(píng)估及臨床治療提供參考。本研究的不足在于樣本量較少，有待進(jìn)一步開展大樣本深入研究。