鄒 鵬，涂繼軍，陳治權(quán)，楊永超，陳新鋒

(1.鄭州市第七人民醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450000；2.鄭州市第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000)

肺炎克雷伯菌是廣泛存在于自然界的一種革蘭陰性條件致病菌，可造成院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染，免疫力低下和大量使用抗生素的患者對(duì)肺炎克雷伯菌易感[1]。隨著抗菌藥物廣泛使用，肺炎克雷伯菌的耐藥性逐年增高，甚至出現(xiàn)一些多重耐藥菌和泛耐藥菌株[2-3]，給臨床治療帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。肺炎克雷伯菌的致病性是由于其攜帶各種毒力因子，這些毒力因子可表達(dá)為各種毒力表型，如莢膜(capsule，CPS)、高黏液性(hypermucoviscous，HMV)、脂多糖、黏附素、鐵獲取系統(tǒng)和生物膜(biofilm，BF)形成能力等。研究表明，攜帶有不同毒力因子的肺炎克雷伯菌的致病能力不同，引起的臨床感染類型也不同[4]。國(guó)內(nèi)外的一些研究已經(jīng)針對(duì)醫(yī)院不同科室感染的肺炎克雷伯菌的耐藥性進(jìn)行報(bào)道[5-6]，對(duì)不同標(biāo)本來(lái)源的肺炎克雷伯菌的分子特性進(jìn)行研究[7-8]。然而，目前對(duì)于骨科患者創(chuàng)面感染的肺炎克雷伯菌的研究報(bào)道較少。因此，本研究對(duì)從鄭州市第七人民醫(yī)院骨科創(chuàng)面感染患者分離的肺炎克雷伯菌進(jìn)行耐藥性和毒力特性研究，以期了解骨科患者創(chuàng)面感染的肺炎克雷伯菌的分子特性和致病性，為防控此類細(xì)菌感染的傳播、流行提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株收集從2017年2月至2019年10月于鄭州市第七人民醫(yī)院骨科住院的創(chuàng)面感染患者分離的32株肺炎克雷伯菌，收集菌株時(shí)剔除同一患者相同部位分離的重復(fù)菌株，32株肺炎克雷伯菌均經(jīng)形態(tài)染色、生化試驗(yàn)初步鑒定，應(yīng)用Vitek-AMS 60全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃生物公司)進(jìn)行菌種鑒定后進(jìn)入后續(xù)試驗(yàn)。大腸桿菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、肺炎克雷伯菌ATCC27853質(zhì)控菌株購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 試劑與儀器營(yíng)養(yǎng)肉湯干粉、哥倫比亞血瓊脂購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，結(jié)晶紫購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，無(wú)水乙醇購(gòu)自天津科密歐試劑有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR) mixture、DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；生物安全柜購(gòu)自青島海爾股份有限公司，隔水式恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，DR100型比濁儀購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司，自動(dòng)立式壓力蒸汽滅菌器購(gòu)自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司，PCR儀、凝膠電泳成像儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藥物敏感性試驗(yàn)根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) 推薦的肉湯稀釋法[9]測(cè)定32株肺炎克雷伯菌對(duì)13種常用抗菌藥物的敏感性，包括氨芐西林 (ampicillin,AMP)、頭孢哌酮(cefoperazone,CFP)、頭孢曲松(ceftriaxone,CRO)、頭孢他啶(ceftazidime,CAZ)、亞胺培南(imipenem,IPM)、復(fù)方磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole,SXT)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、左氧氟沙星(levofloxacin,LEV)、慶大霉素(gentamicin,GEN)、阿米卡星(amikacin,AMK)、加替沙星(gatifloxacin,GAT)、四環(huán)素(tetracyclines,TET)、呋喃妥因(nitrofurantoin,NIT)。具體方法：將13種抗菌藥物以滅菌的肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋成不同的濃度，取100 μL依次加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，再將0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)菌懸液按110稀釋后每孔加入5 μL，室孔內(nèi)菌液的最終濃度為 5×108CFU·L-1，將 96 孔板密封，于37 ℃ 下培養(yǎng) 20 h，觀察孔中液體的濁度變化，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度即為該藥物的最小抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration，MIC)。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)CLSI 2018年版的標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果[9]，如果MIC值達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)時(shí)即判斷為耐藥：AMP≥32 mg·L-1、CFP≥64 mg·L-1、CRO≥4 mg·L-1、CAZ≥16 mg·L-1、IPM≥4 mg·L-1、SXT≥4 mg·L-1、CIP≥4 mg·L-1、LEV≥8 mg·L-1、GEN≥16 mg·L-1、AMK≥64 mg·L-1、GAT≥8 mg·L-1、TET≥16 mg·L-1、NIT≥128 mg·L-1，對(duì)3種以上藥物產(chǎn)生耐藥即可認(rèn)為多重耐藥。

1.3.2 菌株毒力表型的測(cè)定(1)CPS和黏液表型檢測(cè)。采用常規(guī)Hiss莢膜染色法[10]檢測(cè)肺炎克雷伯菌是否形成CPS：按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌涂片后，在涂片區(qū)滴加結(jié)晶紫染液1滴，于火焰上加溫染色30 s，勿使染液沸騰，然后用硫酸銅溶液沖洗染液，自然干燥后進(jìn)行鏡檢，菌體呈紫色，莢膜呈淡紫色。采用“拉絲試驗(yàn)”[11]檢查菌株黏液表型：將肺炎克雷伯菌轉(zhuǎn)接至哥倫比亞血平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，用接種環(huán)蘸取菌落，將接種環(huán)向上提起，若形成的黏絲長(zhǎng)度大于0.5 cm則判定為陽(yáng)性，反之則為陰性。拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性的菌株為HMV表型菌株。(2)BF形成能力測(cè)定。參考文獻(xiàn)[12]采用96孔板結(jié)晶紫染色法測(cè)定肺炎克雷伯菌BF形成能力，具體操作步驟為：將在血平板上活化的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，35 ℃、120 r·min-1搖床培養(yǎng)18～20 h，將獲得的菌液用LB培養(yǎng)基調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?20的比例稀釋后加入96孔培養(yǎng)板中。35 ℃恒溫靜置培養(yǎng)6 h。棄去上層浮游菌，加入 200 μL結(jié)晶紫染液，震蕩混勻，染色15 min，棄去染液，用無(wú)菌水沖掉染液。然后每孔各加 200 μL無(wú)水乙醇，使BF均勻懸浮于無(wú)水乙醇中，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)590 nm處吸光度值。參考文獻(xiàn)[12]標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)過(guò)程中BF染色結(jié)果，將吸光度值≥0.200確定為BF形成。根據(jù)毒力表型將肺炎克雷伯菌分為4種毒力類型，分別是毒力1型 (virulence phenotype 1，VP1):能形成BF的HMV型；毒力2型 (virulence phenotype 2，VP2)：能形成BF型；毒力3型(virulence phenotype 3，VP3)：HMV型；毒力4型(virulence phenotype 4，VP4):不能形成BF的非HMV型[12]。

1.3.3 耐藥基因及毒力基因的檢測(cè)采用煮沸法[13]提取32株待測(cè)菌的基因組DNA，并以此為模版用PCR法擴(kuò)增耐藥基因和毒力基因，PCR反應(yīng)體系25 μL，包括10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+溶液1.5 μL，dNTP Mixture 2.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，rTaq酶(5×106U·L-1)0.1 μL，無(wú)菌水15.4 μL，DNA模板 2.0 μL；PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。耐藥基因包括編碼超廣譜β內(nèi)酰胺(extended-spectrum β-lactamase，ESBLs)酶的基因(blaCTX-M、blaTEM、blaSHV)、碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaOXA-48)、喹諾酮類耐藥基因(qnrA、qnrB、gyrA)；毒力基因包括編碼莢膜多糖基因(magA)、黏附素基因(fimH-1、markD)、腸毒素基因(entB)、黏液表型相關(guān)基因(rmpA)、鐵載蛋白基因(iroNB)。blaCTX-M上游引物：5′-AAAAATCACTGCGTCAGTTCAC-3′，下游引物：5′-AAAAATCACTGCGTCAGTTCAC-3′，長(zhǎng)度867 bp；blaTEM上游引物：5′-CAGAAACGCTGGTGAAAG-3′，下游引物：5′-AACTACGATACGGGAGGG-3，長(zhǎng)度1 183 bp；blaSHV上游引物：5′-GGTTATGCGTTATATTCGCC-3′，下游引物：5′-TTAGCGTTGCCAGTGCTC-3′，長(zhǎng)度865 bp；blaKPC上游引物：5′-GCTACACCTAGCTCCACCTTC-3′，下游引物：5′-CTCCCTAACCCGCAGTTG-3′，長(zhǎng)度912 bp；blaNDM上游引物：5′-GGTTTGGCGATCTGGTTTTC-3′，下游引物：5′-CGGAATGGCTCACGATC-3′，長(zhǎng)度621 bp；blaOXA-48上游引物：5′-TTGGTGGCATCGATTATCGG-3′，下游引物：5′-GAGCACTTCTTTTGTGATGGC-3′，長(zhǎng)度744 bp；qnrA上游引物：5′-TTCAGCAAGAGGATTTCTCA-3′，下游引物：5′-GGCAGC ACTATTACTCCCAA-3′，長(zhǎng)度641 bp；qnrB上游引物：5′-CCTGAGCGGCACTGAATTTAT-3′，下游引物：5′-GTTTGCTGCTCGCCAGTCGA-3′，長(zhǎng)度409 bp；gyrA上游引物：5′-AAATCTGCCCGTGTCGTTGGT-3′，下游引物：5′-AAATCTGCCCGTGTCGTTGGT-3′，長(zhǎng)度744 bp；magA上游引物：5′-GGTG CTCTTTACATCATTGC-3′，下游引物：5′-GCAATGGCCATTTGCGTTAG-3′，長(zhǎng)度1 283 bp；entB上游引物：5′-ATTTCCTCAACTTCTGGGGC-3′，下游引物：5′- AGCATCGGTGGCGGTGGTCA-3′，長(zhǎng)度371 bp；rmpA上游引物：5′-ACTGGGCTACCTCTGCTTCA-3′，下游引物：5′-CTTGCATGAGCCATC TTTCA-3′，長(zhǎng)度516 bp；iroNB上游引物：5′-GGCTACTGATACTTGACTATTC-3′，下游引物：5′-CAGGATACAATAGCCCATAG-3′，長(zhǎng)度992 bp；fimH-1上游引物：5′-GCTCTGGCCGATACCACCACGG-3′，下游引物：5′-GCGAAGTAACGCGCCTGGAACGG-3′，長(zhǎng)度423 bp；markD上游引物：5′-CGGTAAAGTTACCGACGTATCTTGTACTG-3′，下游引物：5′-GCTGTTAACCACACCGGTGGTAAC-3′，長(zhǎng)度498 bp。引物由生工生物(上海)股份有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1 32株肺炎克雷伯菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表1。AMP的MIC≥32.00 mg·L-1有26株，CFP、AMK的MIC≥64.00 mg·L-1分別有20株和8株，CRO、IPM、CIP、SXT的MIC≥4.00 mg·L-1分別有24株、2株、19株和14株，CAZ、GEN和TET的MIC≥16.00 mg·L-1分別有16株、11株和11株；LEV和GAT耐藥折點(diǎn)是8.00 mg·L-1，分別有12株和3株；NIT的MIC≥128.00 mg·L-1有7株。32株肺炎克雷伯菌對(duì)13種藥物的耐藥率為6.25%～81.25%，其中對(duì)AMP的耐藥率最高，為81.25%；其次是CRO和CFP，分別為75.00%和62.50%；在喹諾酮類藥物中，對(duì)CIP的耐藥率最高，為 59.38%，對(duì)第4代喹諾酮類耐藥率最低為9.38%，僅有2株(6.25%)對(duì)IPM產(chǎn)生耐藥。

表1 32株肺炎克雷伯菌對(duì)13種抗菌藥物的MIC值

2.2 32株肺炎克雷伯菌的毒力表型及毒力基因32株肺炎克雷伯菌均能形成CPS，其中21株(65.63%)能形成BF，12株(37.50%)產(chǎn)生HMV。32株肺炎克雷伯菌均攜帶有編碼Ⅰ型菌毛的fimH-1基因,31株(96.88%)攜帶有編碼腸毒素基因entB，30株(93.75%)攜帶有編碼Ⅲ型菌毛基因markD，7株(21.88%)攜帶有編碼黏蛋白調(diào)控基因rmpA，6株(18.75%)攜帶有iroNB基因，3株(9.38%)攜帶有magA基因。

2.3 毒力表型及耐藥性、耐藥基因的相關(guān)性結(jié)果見(jiàn)表2。32株肺炎克雷伯菌中，9株(28.13%)屬于VP1型，均為多重耐藥，對(duì)AMP、CFP、CRO、CAZ、AMK等耐藥，攜帶的耐藥基因主要有blaCTX-M、blaSHV、blaKPC、gyrA、qnrA基因，其中1株為blaOXA-48型；VP2型有12株(占37.50%)，其中多重耐藥菌有9株(82.33%)，攜帶的耐藥基因主要為blaCTX-M、blaKPC、gyrA，3株攜帶qnrA、gyrA基因的菌株僅對(duì)CIP、LEV耐藥；8株VP4菌株中5株為多重耐藥菌，攜帶的耐藥基因?yàn)閎laCTX-M、blaTEM、blaKPC、qnrA、gyrA，其中1株為blaOXA-48。32株肺炎克雷伯菌中，75.0%(24/32)攜帶blakPC基因，均為多重耐藥。

表2 32株肺炎克雷伯菌的毒力類型及耐藥性分布

3 討論

近年來(lái)，從臨床患者分離的肺炎克雷伯菌數(shù)呈增高趨勢(shì)，感染的標(biāo)本來(lái)源科室以重癥監(jiān)護(hù)室為最多，其次是呼吸科和血液科[14]。目前，對(duì)骨科患者分離的肺炎克雷伯菌的耐藥性的研究報(bào)道較少且結(jié)果不盡相同。王學(xué)志等[15]對(duì)224例骨科傷口感染病原進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌對(duì)AMP的耐藥率最高；游明園等[16]研究報(bào)道，骨科患者分離的肺炎克雷伯菌對(duì)部分頭孢類抗菌藥物耐藥率超過(guò)90%。本研究32株肺炎克雷伯菌對(duì)AMP的耐藥率最高，達(dá)到81.25%；對(duì)其他頭孢類抗生素的耐藥率也均超過(guò)50.00%。本研究結(jié)果與王學(xué)志等[15]和游明園等[16]研究結(jié)果相似，說(shuō)明從骨科患者分離的肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢類抗生素的耐藥率較高。但張令博等[17]研究報(bào)道，骨科患者分離的肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢類抗生素的耐藥率低于10%，這與本研究不一致。這種肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢類抗生素耐藥率不同的原因可能是不同地區(qū)流行的肺炎克雷伯菌的分子特性不同，也可能與本地區(qū)醫(yī)院使用抗生素習(xí)慣有關(guān)。

肺炎克雷伯菌主要致病因子包括CPS、產(chǎn)生黏液性、形成BF等，研究表明，編碼這些毒力特性的毒力因子種類很多，包括Khe、magA、wzy、rmpA、allS、kfuBC、ybtA、iucB、iroNB、fimH-1、ureA、uge、wabG及markA等[8]。目前，針對(duì)骨科患者分離的肺炎克雷伯菌的分子特性尤其是毒力類型的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究選擇6種毒力基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，fimH-1和markD基因的攜帶率分別為100.00%和93.75%。fimH-1和markD基因主要編碼Ⅰ型菌門和Ⅲ型菌毛，I型菌毛利用其頂端的黏附素結(jié)合到宿主上皮細(xì)胞的糖蛋白上，介導(dǎo)細(xì)菌侵入到細(xì)胞內(nèi)；Ⅲ型菌毛能牢固地黏附于機(jī)體黏膜上皮細(xì)胞，從而促使BF的形成。entB編碼腸毒素，腸毒素可與血漿載體蛋白中的鐵結(jié)合，促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，當(dāng)entB基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，能使細(xì)菌內(nèi)環(huán)境鐵元素增加，從而促進(jìn)BF的形成[18]。本研究32株肺炎克雷伯菌entB基因的攜帶率為96.88%，這與WALKER等[19]研究報(bào)道一致。一般認(rèn)為HMV菌株為高毒力菌株，在本研究中， 12株(37.5%)表現(xiàn)為HMV表型，而表達(dá)黏液表型的基因rmpA和magA的攜帶率分別為21.88%和9.38%，說(shuō)明HMV表型肺炎克雷伯菌可同時(shí)攜帶rmpA和magA基因。YANG等[20]對(duì)不同來(lái)源的肺炎克雷伯菌分子特性研究發(fā)現(xiàn)，攜帶有magA、rmpA毒力基因的菌株表型不一定表現(xiàn)出高黏液特征。推測(cè)可能還有其他因素參與了肺炎克雷伯菌HMV表型的形成，這有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果還顯示，9株VP1型肺炎克雷伯菌均為多重耐藥菌，且大部分對(duì)AMP、CFP、CAZ、AMK耐藥；VP2型肺炎克雷伯菌的多重耐藥率為83.33%。推測(cè)這種高多重耐藥率可能與細(xì)菌BF形成能力有關(guān)。有研究顯示，BF可通過(guò)物理屏障阻止藥物作用于BF內(nèi)的肺炎克雷伯菌，從而提高肺炎克雷伯菌的耐藥性[21]，這可能也是導(dǎo)致臨床上肺炎克雷伯菌感染率升高的原因之一。研究表明，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶是肺炎克雷伯菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的重要機(jī)制，產(chǎn)ESBLs菌株多呈多重耐藥[22]，而此多重耐藥是由質(zhì)粒攜帶的多種耐藥基因介導(dǎo)。本研究32株肺炎克雷伯菌攜帶的耐藥基因主要為blaCTX-M、blaSHV、blaKPC、gyrA、qnrA，表明本院流行的產(chǎn)ESBLs菌株多為CTX-M型。碳青霉烯類藥物被認(rèn)為是人類抗感染性治療的最后一道防線，然而關(guān)于耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌感染的報(bào)道逐漸增多，尤其產(chǎn)碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase,KPC)被認(rèn)為是目前引起肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因[23]。本研究結(jié)果顯示，75.0%的菌株攜帶有blaKPC基因，且這些菌株均為多重耐藥菌；這與BASSETTI等[24]研究結(jié)果一致。喹諾酮類藥物主要作用于DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV，這2種酶對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和增殖起關(guān)鍵作用。研究表明，肺炎克雷伯菌gyrA基因突變可導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象發(fā)生變化，阻止DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及其他功能，從而引起耐藥[25]。此外，qnrA陽(yáng)性細(xì)菌在經(jīng)過(guò)氟喹諾酮藥物治療后可促進(jìn)細(xì)菌體內(nèi)染色體介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因發(fā)生突變[26]。本研究32株肺炎克雷伯菌中普遍存在gyrA、qnrA 基因，而這2個(gè)基因極易發(fā)生突變；因此，推測(cè)肺炎克雷伯菌對(duì)喹諾酮耐藥的主要機(jī)制是由基因突變引起，但還有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。

綜上所述，從本院骨科創(chuàng)面感染患者分離的肺炎克雷伯菌對(duì)多種抗菌藥物的耐藥率較高，其中對(duì)AMP、頭孢菌素的耐藥率最高；HMV且能形成BF的肺炎克雷伯菌均為多重耐藥菌；攜帶不同耐藥基因的肺炎克雷伯菌的耐藥性不同。因此，在臨床上治療骨科患者創(chuàng)面感染的肺炎克雷伯菌應(yīng)選擇敏感藥物。由于本研究的樣本量有限，今后還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究，以進(jìn)一步確定本地區(qū)骨科患者創(chuàng)面感染的肺炎克雷伯菌的耐藥性和毒力特性，并加強(qiáng)分子流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)，從而制定合理的用藥措施來(lái)減少該類菌株的流行。