李 鑫，洪 萌，侯鐵奇

(1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院眼科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，河南 開封 475000；3.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院眼科中心，廣東 廣州 510630)

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是臨床常見的疾病，多數(shù)患者發(fā)病與遺傳因素有關(guān)，屬于一種嚴(yán)重的、遺傳性、致盲性疾病[1]。RP的遺傳方式有常染色體隱性遺傳(占50.0%～60.0%)、常染色體顯性遺傳(占30.0%～40.0%)和X性連鎖遺傳(占5.0%～15.0%)。RP以視網(wǎng)膜感光細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素細(xì)胞的退行性變?yōu)椴±砀淖儯渲饕R床表現(xiàn)為夜盲、管狀視野，嚴(yán)重影響患者的健康及生活質(zhì)量[2]。目前，RP的治療方法主要包括藥物治療(如維生素A、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、中藥等)、視覺假體裝置治療等。這些治療雖然能改善患者的臨床癥狀，但是尚無(wú)證據(jù)表明何種療法的療效更為確切[3]。

干細(xì)胞是一類特殊細(xì)胞，具備多向分化潛能，干細(xì)胞移植為臨床治療視網(wǎng)膜變性病變提供了新的方法。干細(xì)胞移植方法主要包括局部移植和全身移植。局部移植能將干細(xì)胞直接植入病變部位，其作用靶點(diǎn)確切，細(xì)胞濃度較高；而全身移植主要通過靜脈途徑將干細(xì)胞輸入到血液內(nèi)，干細(xì)胞隨血液循環(huán)到達(dá)損傷或病變的部位，從而達(dá)到治療疾病的目的。有研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cell，BMSC)移植有助于延緩病情發(fā)展，減緩感光細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[4]。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、抑制炎癥等生理特征，成為多種疾病治療的重要細(xì)胞來(lái)源[5]。但是，尚未見有研究將BMSC用于大鼠RP的治療。本研究旨在探討大鼠BMSC的分離制備方法及其對(duì)RP大鼠視網(wǎng)膜的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物47只8周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌性24只，雄性23只，體質(zhì)量230～270 (250±20) g，由河南大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(豫)2011-0004。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，溫度(20.0±2.0)℃，濕度50%～60%，自由攝食(建立模型前12 h禁食)、飲水，每日光照12 h。本研究對(duì)大鼠的處理符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[6]的相關(guān)要求，并通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器速眠新注射液購(gòu)自吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司，鹽酸奧布卡因滴眼液購(gòu)自日本參天制藥株式會(huì)社，小鼠抗人線粒體抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，CD45、CD29及CD44抗體購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，血清腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF) 、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板購(gòu)自海德創(chuàng)業(yè)(北京)生物科技有限公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自賽默飛世爾科技(上海)有限公司，熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，顯微手術(shù)器械購(gòu)自蘇州明仁醫(yī)療器械公司，冰凍切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠BMSC分離和制備取SD大鼠2只(雌雄各1只)，采用頸椎脫臼法處死，以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡5 min，無(wú)菌條件下分離脛骨、股骨，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)反復(fù)沖洗，去除干骺端，充分暴露骨髓腔，應(yīng)用10 mL注射器抽取含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行骨髓腔沖洗，應(yīng)用吸管吹打收集的細(xì)胞，將細(xì)胞以1×109L-1密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中，48 h后全量換液1次，制備大鼠BMSC。

1.3.2 BMSC鑒定(1)細(xì)胞形態(tài)觀察：分別取分離培養(yǎng)的細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。(2)生長(zhǎng)曲線鑒定：取第3代BMSC，胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×107L-1，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取均值，連續(xù)觀察7 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。(3)流式細(xì)胞儀鑒定：取第3代BMSC，胰蛋白酶消化后PBS沖洗3次，細(xì)胞濃度控制在3.9×108L-1，取4 mL，分別裝入4支離心管中，每支離心管內(nèi)1 mL，再分別加入CD45、CD29及CD44抗體，空白對(duì)照不做任何處理，連續(xù)孵育30 min后，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD45+、CD29+及CD44+細(xì)胞純度。

1.3.3 BMSC懸液制備取BMSC培養(yǎng)液5 μL，加入2 mL氯甲基苯甲酰胺-1,1,-二十八烷基-3,3,3,3,-四甲基吲哚碳菁(chlormethylbenzamido-1,1,-dioctadecyl-3,3,3,3,-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,CM-Dil)熒光液，完成細(xì)胞標(biāo)記，輕輕吹打3 min，1 500 r·min-1離心5 min，棄去上層清液，采用生理鹽水重懸BMSC，控制細(xì)胞密度為1×109L-1。

1.3.4 RP大鼠模型制備及處理將45只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、RP組和BMSC組，每組15只。對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)，不制備RP大鼠模型。RP組和BMSC組大鼠采用碘酸鈉(NaIO3)法建立RP大鼠模型：取新鮮配制的40 g·L-1NaIO3溶液，使用1 mL注射器對(duì)每只大鼠局部視網(wǎng)膜下注射0.15 mL NaIO3溶液(40 g·L-1)，每日1次，連續(xù)注射7 d。本研究中SD大鼠均建模成功，未見感染、死亡大鼠[7]。建模成功后，RP組大鼠局部視網(wǎng)膜下注射0.15 mL生理鹽水，BMSC組大鼠局部視網(wǎng)膜下注射BMSC懸液0.15 mL(細(xì)胞密度為1×109L-1)，每日1次，連續(xù)注射7 d；干預(yù)完畢后以酒精棉球擦拭、消毒注射部位，正常飼養(yǎng)1個(gè)月[8]。對(duì)照組大鼠不采取任何干預(yù)措施。

1.3.5 血清BDNF、IL-10水平檢測(cè)分別于造模前、造模后及干預(yù)后1個(gè)月采集3組大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下尾靜脈血3 mL，1 500 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清BDNF、IL-10水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.6 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織病變部位組織形態(tài)干預(yù)后1個(gè)月，采用斷頸法處死大鼠，完整取出眼球，剪除角膜和視神經(jīng)；40 g·L-1多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明；石蠟包埋，切片(厚度約4 μm)，烤片；二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；蘇木精、伊紅染色，中性樹膠封片；光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜病變部位組織形態(tài)[9]。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSC形態(tài)倒置顯微鏡觀察顯示，制備的BMSC培養(yǎng)2 h后開始貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)2 d后伸出偽足，且長(zhǎng)短不一(見圖1A)；培養(yǎng)4 d后快速增長(zhǎng)，細(xì)胞開始集落排列，細(xì)胞質(zhì)豐富(見圖1B)；細(xì)胞傳代后分布相對(duì)均勻，形態(tài)纖長(zhǎng)，細(xì)胞排列一致，呈旋渦或放射狀(見圖1C)。

A：BMSC培養(yǎng)2 d;B：BMSC培養(yǎng)4 d;C：第3代BMSC。

2.2 大鼠BMSC生長(zhǎng)曲線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示(圖2)，BMSC接種第1～2 天為潛伏期，細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)緩慢；BMSC接種第3～5天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速。

圖2 SD大鼠BMSC生長(zhǎng)曲線

2.3 大鼠BMSC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果第3代大鼠BMSC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，CD45+、CD29+、CD44+細(xì)胞率分別為1.33%、79.95%、81.49%，見圖3。

A：CD45+細(xì)胞；B：CD29+細(xì)胞；C：CD44+細(xì)胞。

2.4 3組大鼠血清BDNF、IL-10水平比較結(jié)果見表1。造模前，3組大鼠血清BDNF、IL-10水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后，RP組和BMSC組大鼠血清BDNF、IL-10水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RP組和BMSC組大鼠造模后血清BDNF、IL-10水平顯著低于造模前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BMSC組大鼠干預(yù)后血清BDNF、IL-10水平顯著高于造模后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)后，BMSC組大鼠血清BDNF、IL-10水平顯著高于RP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組大鼠造模前、造模后、干預(yù)后血清BDNF、IL-10水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 3組大鼠血清BDNF和IL-10水平比較

2.5 干預(yù)后1個(gè)月3組大鼠視網(wǎng)膜病變部位組織形態(tài)結(jié)果見圖4。HE染色顯示，對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞完好；RP組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列紊亂，存在許多細(xì)胞碎片；與RP組比較，BMSC組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列相對(duì)整齊，細(xì)胞碎片顯著減少。

A：對(duì)照組；B：RP組；C：BMSC組。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞的一種，該細(xì)胞源于胚胎發(fā)育的中胚層，是一種多功能干細(xì)胞，具備自我更新、多向分化及免疫抑制等多種作用。有研究顯示，將間充質(zhì)干細(xì)胞用于RP中有助于改善視覺敏感度、視網(wǎng)膜電流圖等，可抑制感光細(xì)胞層的細(xì)胞凋亡，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[10]。為了保證本研究的順利完成，實(shí)驗(yàn)開始就分離并制備BMSC。目前BMSC體外分離方法較多，主要包括貼壁法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選法等[11]。

本研究通過貼壁法進(jìn)行BMSC分離與制備，發(fā)現(xiàn)BMSC培養(yǎng)2 h后開始貼壁生長(zhǎng)，2 d后伸出偽足，4 d后快速增長(zhǎng)，呈梭形；BMSC接種第1～2 天為潛伏期，細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)緩慢；BMSC接種第3～5天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速。大鼠第3代BMSC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，CD45+、CD29+、CD44+細(xì)胞率分別為1.33%、79.95%、81.49%；表明貼壁法可以獲得純度相對(duì)較高的BMSC，并且操作方法相對(duì)簡(jiǎn)單，為本研究的順利進(jìn)行提供了一定的基礎(chǔ)。

間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分泌大量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、BDNF等，而BDNF是維持細(xì)胞功能、影響神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞分化的重要因素。同時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞還能夠分泌各種炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL-6、IL-10等，這些細(xì)胞因子在體內(nèi)可以調(diào)節(jié)由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，還對(duì)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的成熟、分化和增殖等起到顯著調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，RP組和BMSC組大鼠造模后血清BDNF、IL-10水平顯著低于造模前，BMSC組大鼠干預(yù)后血清BDNF、IL-10水平顯著高于造模后；干預(yù)后，BMSC組大鼠血清BDNF、IL-10水平顯著高于RP組；另外，HE染色顯示，RP組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列紊亂，存在許多細(xì)胞碎片；與RP組比較，BMSC組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列相對(duì)整齊，細(xì)胞碎片顯著減少；該結(jié)果提示BMSC能夠促進(jìn)RP大鼠受損視網(wǎng)膜修復(fù)。BMSC對(duì)RP大鼠受損視網(wǎng)膜修復(fù)的可能作用機(jī)制為：(1)血-視網(wǎng)膜屏障是維持人體視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與功能的重要系統(tǒng)，能調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，BMSC移植后能縮小細(xì)胞之間的間隙，降低視網(wǎng)膜血管的通透性，為視網(wǎng)膜定向歸巢創(chuàng)造條件[12]；(2)BMSC移植后能對(duì)視網(wǎng)膜形成相應(yīng)的保護(hù)作用，有助于延緩病情發(fā)展，促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)；(3)BMSC本身具備神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、抑制炎癥反應(yīng)等作用，有助于維持細(xì)胞功能，抑制炎癥反應(yīng)，且對(duì)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的成熟、分化及增殖等有良好的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，貼壁法能成功制備大鼠BMSC，BMSC可以顯著提高RP大鼠血清BDNF、IL-10水平，促進(jìn)受損視網(wǎng)膜修復(fù)，但其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。