肖夢(mèng)珂，華 宇，馮瑩瑩，路江濤，翟海暉，王天云，賈巖龍

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamsters ovary,CHO)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于重組蛋白藥物(抗體、疫苗)的研發(fā)和生產(chǎn)[1]，但應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白時(shí)目的蛋白的表達(dá)水平較低以及表達(dá)失穩(wěn)是目前亟待解決的問題[2]。選擇合適的啟動(dòng)子對(duì)提高重組蛋白的產(chǎn)量具有重要意義。巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動(dòng)子是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)重組蛋白表達(dá)的最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一，啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)是目的蛋白表達(dá)的關(guān)鍵步驟[3-4]。研究表明，超級(jí)核心啟動(dòng)子(super core promoter,SCP)能夠增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄活性，提高目的蛋白表達(dá)及其穩(wěn)定性[5-6]。本研究通過構(gòu)建不同啟動(dòng)子(CMV啟動(dòng)子、Natural CMV啟動(dòng)子、SCP2和SCP3)驅(qū)動(dòng)的真核表達(dá)載體并分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，檢測(cè)啟動(dòng)子對(duì)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)表達(dá)及穩(wěn)定性的影響,為設(shè)計(jì)表達(dá)載體時(shí)選擇適用于穩(wěn)定高產(chǎn)重組蛋白的啟動(dòng)子提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器CHO-K1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室馴化保存。達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbeco′s modified Eagle′s medium，DMEM)-F12購(gòu)自河南普諾易生物制品研究院有限公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶消化液購(gòu)自上海吉諾生物科技有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))公司，殺稻瘟菌素篩選試劑購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，TRIzol Reagent試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)儀購(gòu)自瑞士羅氏公司；以CMV、Natural CMV、SCP2、SCP3為啟動(dòng)子、EGFP為報(bào)告基因、殺稻瘟菌素為篩選基因的表達(dá)載體CMV-vector、Natural CMV-vector、SCP2-vector、SCP3-vector由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成，CMV啟動(dòng)子的堿基序列為5′-AGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGC-TTAACTGGCTTATCGAAAT-3′，Natural CMV啟動(dòng)子的堿基序列為5′-AGGTCTATATAAGCAGAGCTCG-TTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATC-CACGCTGTTTTGACCTCCATAGAA-3′，SCP2啟動(dòng)子的堿基序列為5′-AGGTCTATATAAGCAGAGCTCG-TTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGTCGAG-CCGAGTGGTTGTGCCTCCATAGAA-3′；SCP3啟動(dòng)子的堿基序列為5′-AGGTCTATATAAGCAGAGCTC-GTTTAGTGAACCGTCAGTCCGCCTGGAGACCTCGA-GCCGAGTGGTCGTGCCTCCATAGAA-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組將CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U·L-1青霉素、鏈霉素溶液的DMEM-F12培養(yǎng)基中，于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CHO-K1細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板。根據(jù)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的不同將細(xì)胞分為對(duì)照組、Natural CMV組、SCP2組和SCP3組，每種載體設(shè)3個(gè)復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約70%時(shí)，使用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑2 μL分別將1 μg CMV-vector、1 μg Natural CMV-vector、1 μg SCP2-vector、1 μg SCP3-vector質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法按照試劑盒說明進(jìn)行。收集轉(zhuǎn)染48 h的4組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 熒光倒置顯微鏡觀察4組細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染48 h后，通過熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，計(jì)算EGFP陽性和陰性細(xì)胞數(shù)，以EGFP陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比表示轉(zhuǎn)染效率,分析報(bào)告基因EGFP瞬時(shí)表達(dá)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4組細(xì)胞中EGFP表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后，使用含15 mg·L-1殺稻瘟菌素的培養(yǎng)基篩選細(xì)胞7 d后未成功轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞死亡，將成功轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞改用含低濃度殺稻瘟菌素(7.5 mg·L-1)的培養(yǎng)基維持培養(yǎng)7 d后獲得第1代多克隆細(xì)胞，并繼續(xù)傳代培養(yǎng)至第30代。分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第1代和第30代細(xì)胞，1 000 r·min-1離心 5 min，吸棄上清，重懸于200 μL的磷酸鹽緩沖液中，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組第1代和第30代多克隆細(xì)胞中EGFP表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)，MFI=細(xì)胞總熒光強(qiáng)度/細(xì)胞總數(shù)，以MFI代表EGFP蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 qRT-PCR法檢測(cè)4組細(xì)胞中EGFP mRNA相對(duì)表達(dá)量收集4組穩(wěn)定篩選的第30代多克隆細(xì)胞，根據(jù)TRIzol Reagent試劑盒說明書提取總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。EGFP上游引物序列為5′-CTACGTCCAGGAGCGCACCATCT-3′，下游引物序列為5′-GTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATAT-3′；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物序列為5′-CGACCCCTTCATTGACCTC-3′，下游引物序列為5′-CTCCACGACATACTCAGCACC-3′。qRT-PCR 反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，SYBR Green Buffer 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)45個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算EGFP mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率比較結(jié)果見圖1。對(duì)照組、Natural CMV組、SCP2組、SCP3組細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率分別為(67.00±2.65)%、(66.67±7.09)%、(74.00±4.36)%、(80.33±1.53)%。對(duì)照組、Natural CMV組、SCP2組細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SCP3組細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：對(duì)照組；2：Natural CMV組；3：SCP2組；4：SCP3組。

2.2 4組細(xì)胞中EGFP蛋白表達(dá)水平比較結(jié)果見表1。對(duì)照組、Natural CMV組、SCP2組、SCP3組第1代多克隆細(xì)胞中EGFP蛋白表達(dá)水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組、Natural CMV組、SCP2組第30代多克隆細(xì)胞中EGFP蛋白表達(dá)水平兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組、Natural CMV組、SCP2比較，SCP3組第30代多克隆細(xì)胞中EGFP蛋白表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 4組細(xì)胞中EGFP蛋白表達(dá)水平比較

2.3 4組第30代多克隆細(xì)胞中EGFP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較對(duì)照組、Natural CMV組、SCP2組、SCP3組第30代多克隆細(xì)胞中EGFP mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.02、1.04±0.08、1.26±0.06、1.38±0.06。對(duì)照組與Natural CMV組第30代多克隆細(xì)胞中EGFP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SCP2組、SCP3組第30代多克隆細(xì)胞中EGFP mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組、Natural CMV組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SCP3組第30代多克隆細(xì)胞中EGFP mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于SCP2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

CHO細(xì)胞是目前生產(chǎn)重組蛋白藥物常用的細(xì)胞系之一，但是在細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中重組蛋白表達(dá)量及穩(wěn)定性逐漸降低。表達(dá)載體的優(yōu)化對(duì)于提高外源基因在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及穩(wěn)定性至關(guān)重要[7]。啟動(dòng)子是表達(dá)載體的重要組成部分，核心啟動(dòng)子是基因精確轉(zhuǎn)錄所必需的DNA序列，但啟動(dòng)子本身容易受到干擾，導(dǎo)致重組蛋白在長(zhǎng)期培養(yǎng)中產(chǎn)量下降或表達(dá)不穩(wěn)定[5]。研究表明，SCP1和SCP2在HeLa細(xì)胞和果蠅中的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)[8]。SCP3可促進(jìn)人宮頸癌細(xì)胞HeLa S3和人骨髓源性神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y中靶基因的瞬時(shí)表達(dá)和長(zhǎng)期表達(dá)穩(wěn)定性[9]。然而，SCP在CHO細(xì)胞中的作用尚不清楚。

為了研究不同核心啟動(dòng)子對(duì)CHO細(xì)胞中重組蛋白表達(dá)的影響，本課題組構(gòu)建了4種核心啟動(dòng)子(CMV核心啟動(dòng)子、Natural CMV核心啟動(dòng)子、SCP2和SCP3)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，分析其對(duì)EGFP瞬時(shí)表達(dá)以及長(zhǎng)期穩(wěn)定性表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，SCP3組細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率顯著高于對(duì)照組，與對(duì)照組、Natural CMV組、SCP2比較，SCP3組第30代多克隆細(xì)胞中EGFP表達(dá)水平顯著增高；這一結(jié)果表明，在細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中，重組蛋白的產(chǎn)量和穩(wěn)定性會(huì)受到表達(dá)載體的啟動(dòng)子元件相互作用的影響，這與之前的研究結(jié)果一致[10-11]。有報(bào)道證實(shí)，SCP已經(jīng)被用于TFIID與DNA結(jié)合的生物分析、轉(zhuǎn)錄過程的生物化學(xué)研究以及促進(jìn)基因表達(dá)，SCP與CMV增強(qiáng)子的協(xié)調(diào)作用提高了EGFP報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性[12-13]。本研究結(jié)果顯示，SCP2組、SCP3組第30代多克隆細(xì)胞的EGFP mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組、Natural CMV組，SCP3組第30代多克隆細(xì)胞的EGFP mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于SCP2組，表明核心啟動(dòng)子不僅可以影響轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)，而且可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄水平。

綜上所述，SCP3不僅可以驅(qū)動(dòng)高水平的轉(zhuǎn)錄，而且可以提高EGFP的表達(dá)及其穩(wěn)定性，為哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化提供了一種潛在的新型策略。后續(xù)研究中，將利用核心啟動(dòng)子的不同元件排列組合進(jìn)行啟動(dòng)子的合成生物學(xué)分析，以期找到高效穩(wěn)定的強(qiáng)啟動(dòng)子用于重組蛋白的表達(dá)。