徐家星，張俊武，馬紅艷

(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院學(xué)院，天津 300457)

0 引 言

柔性導(dǎo)電薄膜，是既具備良好的柔韌性，又具有優(yōu)異的導(dǎo)電性的復(fù)合光電材料[1]。根據(jù)其材料組成的不同，導(dǎo)電薄膜可以分為氧化物薄膜[2]、有機(jī)高分子導(dǎo)電薄膜[3]、金屬導(dǎo)電薄膜[4]和納米金屬線導(dǎo)電薄膜[5]。在導(dǎo)電柔性材料研究的早期，導(dǎo)電薄膜所采用的材料主要是氧化銦錫(ITO)，但是，此種材料成本較高，原料稀缺且柔韌性較差的特點(diǎn)限制了它在柔性導(dǎo)電材料方向的應(yīng)用和發(fā)展[6]。和氧化銦錫制備的柔性導(dǎo)電薄膜相比，納米銀線制備的柔性導(dǎo)電薄膜在導(dǎo)電性和透明度等方面都展現(xiàn)了相似甚至更優(yōu)的性能。納米銀導(dǎo)電薄膜的制備技術(shù)日益成熟，使用前景越來越廣泛。Akter等[7]通過使用表面活性物質(zhì)來改善柔性薄膜襯底的親水性，調(diào)節(jié)表面張力，制備出了均勻性較好、導(dǎo)電性優(yōu)良且透光率高的柔性導(dǎo)電薄膜。Lin等[8]將石墨烯和納米銀線溶液混合作為噴涂溶液，制備出了方阻300 Ω/sq，透光率高于80%的柔性導(dǎo)電薄膜。Guo等[9]通過低速度的旋涂法制備出了均勻性和導(dǎo)電性優(yōu)異的導(dǎo)電薄膜，其透光率在95%以上，方阻大幅降低到20 Ω/sq以下，展現(xiàn)出比傳統(tǒng)材料氧化銦錫更為優(yōu)異的性能。因?yàn)槠湓絹碓絻?yōu)異的親水性，柔韌性和導(dǎo)電性，柔性導(dǎo)電薄膜材料在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用逐步拓展。鑒于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的特殊性，所使用的材料的生物安全性能是不容忽視的研究目標(biāo)。目前，對于柔性導(dǎo)電材料生物安全性的研究，處于起步階段，鮮有系統(tǒng)性的研究與報(bào)道。

銀的抗菌作用和機(jī)制已被人類使用和研究了數(shù)千年。普遍認(rèn)為，當(dāng)帶正電的銀離子與致病菌細(xì)胞膜接觸時(shí)會產(chǎn)生吸附作用，隨后會攻擊細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡[10]。納米銀與銀離子有著不同的抗菌機(jī)理與效果，施慶珊[11]等人的研究發(fā)現(xiàn)，銀離子比納米銀粒子有更強(qiáng)的抗菌活性。由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，納米銀線的抗菌性能也不同于納米銀顆粒。因此，用其制成的柔性導(dǎo)電薄膜，用于醫(yī)療領(lǐng)域時(shí)，其表現(xiàn)出的抗菌性能目前尚不明確，國內(nèi)外有很多研究關(guān)注于納米銀線柔性導(dǎo)電薄膜的導(dǎo)電性、柔韌性和透光性[12-15]，但是對于其抗菌性能的研究卻鮮有報(bào)道。隨著其應(yīng)用從傳統(tǒng)的太陽能，觸控屏，顯示屏等領(lǐng)域[16-19]，逐漸擴(kuò)展到材料醫(yī)學(xué)等與人體相關(guān)的領(lǐng)域[20-21]，探究其對常見致病菌的抗菌效果尤為重要。

除了抗菌性的研究，在醫(yī)療領(lǐng)域，納米銀柔性導(dǎo)電膜的生物安全性也越來越引起關(guān)注。研究表明，高濃度的納米銀也對人體產(chǎn)生一定的風(fēng)險(xiǎn)。張紫虹[22]等人使用納米銀復(fù)合醋酸氯已定消毒凝膠進(jìn)行動物皮膚刺激試驗(yàn)，結(jié)果表明其樣品未產(chǎn)生刺激性。陳炯[23]等將納米銀敷料應(yīng)用于Ⅱ度臨床燒傷患者。研究結(jié)果顯示，此敷料未在患者體內(nèi)產(chǎn)生銀沉積，使用樣品在銀代謝安全范圍內(nèi)。

本研究采用多元醇還原法，通過優(yōu)化溫度，反應(yīng)時(shí)間等因素，使用二水合氯化銅作為穩(wěn)定劑，制備出了長度在5～10 μm左右，長徑比為50～100左右的AgNWs。進(jìn)而采用噴涂法，通過使用自制凹槽模具，制備了銀線鋪展均勻的AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜。最后，探究了AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等幾種常見致病菌的的抗菌效果，并通過柔性薄膜在生理鹽水中銀含量的釋放規(guī)律的定量分析以及其對人成纖維細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)的影響，進(jìn)一步評估了其可能造成的細(xì)胞毒性風(fēng)險(xiǎn)大小。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 主要試劑材料

無水乙醇(分析純)，天津市匯杭化工科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(pvpK29-32)，上海晶純生化科技股份有限公司；硝酸銀(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二水合氯化銅(分析純)，上海晶純生化科技股份有限公司；PDMS，東烷市藝輝膠粘劑有限公司；乙二醇(分析純)，天津百倫斯生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Invitrogen SYTO9 染色劑，上海恒斐生物科技有限公司；胎牛血清，上海江林生物科技有限公司；青霉素鏈霉素溶液，北京百奧萊博科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基，上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

WPL-65BE型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；YA28X-4T/10Ⅱ型高壓蒸汽滅菌鍋，寧波永興醫(yī)療器械公司；JSM-6380 LV型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社，樣品噴金處理，掃描電壓20 kV，放大倍數(shù)2000倍、5000倍；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ZNCL-TS50ML型智能磁力攪拌器，天津科諾儀器設(shè)備有限公司；UCS-650型超聲波細(xì)胞破碎儀，杭州米歐儀器有限公司，調(diào)節(jié)頻率40 kHz，工作周期45s，間隔時(shí)間5s；ICAPQ型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，德國賽默飛世爾，；HNY-200B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；FE28型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司； BioTek Cytation 1細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)，北京安麥格貿(mào)易有限公司。

1.3 AgNWs的制備

取純乙二醇作為稀釋劑，分別配置5 mM CuCl2溶液、0.15 M聚乙烯吡咯烷酮(pvpK29-32)溶液和0.1 M AgNO3溶液。然后，將10 mL純乙二醇加入50 mL圓底燒瓶中，放入智能磁力攪拌器。調(diào)節(jié)智能磁力攪拌器溫度為150 ℃，轉(zhuǎn)速為260 rpm，反應(yīng)1 h后，加入100 μl的CuCl2溶液，再過20 min，緩慢加入3 mL pvpK29-32溶液和3 mL AgNO3溶液，隨后再加熱1h，室溫下冷卻30 min，最后用50 mL的乙醇和去離子水在2000 rpm，20 min的條件下分別離心洗滌兩次，將純化后的納米銀線(AgNWs)乙醇溶液放于4 ℃冰箱內(nèi)保藏。

1.4 AgNWs/PDMS柔性透明導(dǎo)電薄膜的制備

將分散、調(diào)配好的AgNWs乙醇溶液裝入噴槍，調(diào)節(jié)噴槍噴頭高度為40 mm、噴頭氣壓控制在10 kPa。同時(shí)在基底材料(聚四氟乙烯，凹槽尺寸4×4 cm2，凹槽深度1 mm)表面粘附涂易樂FS-204表面活性劑來改善基底材料的親水性。然后采用噴涂法將配置的AgNWs乙醇溶液均勻噴涂在潔凈的基底上。噴涂結(jié)束后，將材料放入150 ℃處理30 min，隨后將PDMS的A液與B液按10:1的比例混勻，填入凹槽，去除多余試劑，150 ℃處理30 min，得到AgNWs/PDMS柔性透明導(dǎo)電薄膜，實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。

圖1 柔性導(dǎo)電薄膜制備流程圖Fig 1 Fabrication process of flexible conductive film

1.5 AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜抗菌性實(shí)驗(yàn)

將AgNWs含量分別為0、0.12、0.24、0.36 mg/cm2的AgNWs/PDMS薄膜用打孔器分別打成直徑為6mm的圓片，并在紫外燈下滅菌5h，每隔30 min翻面一次，使薄膜表面充分殺菌。將大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、銅綠假單胞菌(PAO1)菌液活化，并分別取200 uL對數(shù)生長期菌液，用LB培養(yǎng)基在24孔板中分別梯度稀釋105倍，將薄膜圓片放入培養(yǎng)液中，在37 ℃，160 rpm條件下培養(yǎng)24 h。然后將膜圓片用滅菌處理后的鑷子輕輕取出，用PBS涮洗3次后，將膜圓片放入50 mL的離心管中，加入10 mL的 PBS緩沖液，在超聲破碎儀中，以40 kHz的頻率，超聲40 s，間隔時(shí)間為5 s。最后將超聲后菌液進(jìn)行梯度稀釋，并最終選取2.5 μL，稀釋倍數(shù)為 103倍的稀釋液在相應(yīng)的平板上點(diǎn)樣進(jìn)行菌落個(gè)數(shù)的測定。

1.6 AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜在生理鹽水中累積銀含量的測定

將AgNWs含量分別為0.12、0.24和0.36 mg/cm2，直徑為6 mm的薄膜圓片各5個(gè)，UV滅菌處理后，分別浸泡于10 mL生理鹽水中，在1、5、10、20、30天時(shí)分別取浸泡液，用德國賽默飛世爾ICAPQ型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定浸泡液中銀的含量。

1.7 AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜對人真皮成纖維細(xì)胞形態(tài)影響實(shí)驗(yàn)

將滅菌處理過的AgNWs含量為0.12、0.24和0.36 mg/cm2，直徑為6 mm的薄膜圓片與接種量106個(gè)細(xì)胞/孔的人真皮成纖維細(xì)胞置于TCPS板中，留出一個(gè)不加材料的作為空白對照，加入添加了10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素鏈霉素(PS)的改良的DMEM培養(yǎng)基100 μL，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱共培養(yǎng)48 h后，用Invitrogen SYTO9 染色劑染色，并用Cytation1 多功能熒光成像檢測系統(tǒng)觀察。

1.8 圖像和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用軟件ImageJ(V1.8.0)對AgNWs與AgNWs/PDMS電鏡圖片進(jìn)行物理結(jié)構(gòu)觀察和分析；利用軟件SPSS(IBM, V. 24)對AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜抗菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及在生理鹽水中擴(kuò)散的銀含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行單向方差分析，進(jìn)而探討其抗菌性能及其細(xì)胞毒性。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNWs及AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜微觀結(jié)構(gòu)觀察與分析

使用日本JSM 6380 LV掃描電子顯微鏡SEM分別表征AgNWs以及AgNWs/PDMS薄膜的微觀結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。進(jìn)而通過ImageJ(V1.8.0)對圖像進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，銀線長度大部分在5～10 μm左右，長徑比在50～100左右，銀顆粒含量較少，沒有聚集成團(tuán)的現(xiàn)象。此結(jié)果表明，本研究使用的制備方法可以有效促進(jìn)銀線形成多重欒晶，減少銀線顆粒的形成，并促進(jìn)欒晶向銀線方向的延長，增加銀線的生長長度。AgNWs/PDMS薄膜電鏡表征顯示，PDMS層與AgNWs層的分界較為明顯，銀線鋪展均勻，銀顆粒含量較少，AgNWs層厚度在10μm左右，AgNWs層表面較為粗糙，PDMS層質(zhì)地均勻，雜質(zhì)含量較少。表明本研究所采用的借助凹槽模具的方法可以有效控制薄膜的物理結(jié)構(gòu)，控制銀線層涂覆的均勻性。

圖2 銀納米線的電鏡圖(a)與柔性導(dǎo)電薄膜電鏡圖(b)Fig 2 SEM images of AgNWs and SEM images of AgNWs/PDMS film

2.2 AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜抗菌性能

圖3是不同AgNWs含量的AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜對三種致病菌E.coli，S.Aureus和PAO1抗菌率的比較。經(jīng)SPSS(IBM, V. 24)使用單向方差分析，不含AgNWs的PDMS薄膜和含AgNWs的AgNWs/PDMS薄膜上的E.coli、S.aureus、PAO1的菌落數(shù)差異顯著(p<0.05)。相比不含AgNWs的PDMS膜，當(dāng)AgNWs/PDMS 膜的AgNWs含量達(dá)到0.36 mg/cm2時(shí)，E.coli菌落數(shù)減少了13倍左右，PAO1菌落數(shù)減少了21倍左右，S.aureus菌落數(shù)減少了42倍左右。與不含AgNWs的PDMS膜相比，隨著AgNWs含量的逐步增加，AgNWs含量為0.12、0.24和0.36 mg/cm2的AgNWs/PDMS薄膜上粘附的三種致病菌的菌落數(shù)逐漸減少，與對照組的差異顯著性也逐漸增加。

圖3 AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜單位面積菌落個(gè)數(shù)Fig 3 AgNWs/PDMS flexible conductive film number of colonies per unit area

2.3 AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜中銀的釋放規(guī)律

圖4是經(jīng)過30天的浸泡，AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜在生理鹽水中釋放的累積銀濃度。結(jié)果表明，不含AgNWs的PDMS薄膜以及不同AgNWs含量的AgNWs/PDMS薄膜之間，在生理鹽水中釋放的銀含量差異顯著(p<0.05)。其中0.36mg/cm2AgNWs含量的薄膜圓片比0.12 mg/cm2AgNWs的銀含量高3倍以上(p<0.01)，差別顯著。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，AgNWs/PDMS薄膜中銀的釋放，在起始的1-2天呈現(xiàn)出大量的釋放量，后面的時(shí)間內(nèi)一直呈現(xiàn)穩(wěn)定的少量累積釋放。這個(gè)結(jié)果表明，銀的釋放符合突釋規(guī)律，其突釋期累積釋放率在80%以上。這個(gè)結(jié)果表明，通過樣品的預(yù)先浸泡處理，可降低因?yàn)殂y釋放而可能誘發(fā)的細(xì)胞毒性。

圖4 柔性導(dǎo)電薄膜在生理鹽水中銀含量釋放規(guī)律圖Fig 4 The silver content release pattern of flexible conductive film in normal saline

表1是經(jīng)過30天浸泡，AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜最終釋放的銀含量占薄膜總銀量的比例。結(jié)果表明，薄膜圓片在生理鹽水中銀含量不僅隨著浸泡時(shí)間的延續(xù)逐漸增加，并且隨著薄膜中AgNWs含量的增加而提高，最終穩(wěn)定在薄膜本身銀含量的10%左右。

表1 最終生理鹽水中的含銀量占薄膜含銀量的比例

2.4 AgNWs/PDMS柔性導(dǎo)電薄膜的毒性評估

表2是浸泡在生理鹽水30天后，不同AgNWs含量的AgNWs/PDMS薄膜在生理鹽水中最終穩(wěn)定的銀濃度。根據(jù)熊玲等[24]和熊旭華[25]的納米銀的毒性評估標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)納米銀粒徑在100 nm以下，銀濃度在一定范圍內(nèi)(2.5～25)μg/mL時(shí)，呈現(xiàn)輕微細(xì)胞毒性(0～1)級，毒性大小與含量呈量效關(guān)系，并隨著濃度增加而增加。當(dāng)大于50 μg/mL時(shí)，顯示出明顯的細(xì)胞毒性，量-效相關(guān)性也隨之消失，粒徑較小的微米銀(0.50～1.67 μm)在銀濃度達(dá)到250 μg/mL時(shí)顯示明顯的細(xì)胞毒性，粒徑較大的微米銀粒子(1.43～7.14 μm, 1.74～45 μm)在所有試驗(yàn)濃度下未顯示細(xì)胞毒性，且同粒徑的納米銀線毒性弱于納米顆粒。本研究所制備納米銀線直徑在100 nm左右，結(jié)合表2得出結(jié)論，0.36 mg/cm2AgNWs含量的薄膜會產(chǎn)生輕微的細(xì)胞毒性(0～1)級，0.12 mg/cm2、0.24 mg/cm2AgNWs含量的薄膜不會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

表2 生理鹽水中最終的含銀量

進(jìn)一步通過人真皮成纖維細(xì)胞與3個(gè)不同濃度的AgNWs/PDMS導(dǎo)電薄膜圓片共培養(yǎng)，48 h 染色后觀察細(xì)胞形態(tài)觀察，結(jié)果如圖5所示。與對照相比，和3種薄膜圓片共培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞均形態(tài)正常貼壁，并未造成明顯的細(xì)胞死亡現(xiàn)象，說明短期時(shí)間內(nèi)銀的積累均未造成明顯的細(xì)胞毒性。3種薄膜材料的生物安全性，可以滿足其用于人皮膚表面相關(guān)醫(yī)療材料的用途.

圖5 人成纖維細(xì)胞形態(tài) (a)TCPs對照(b)AgNWs 0.12mg/cm2(c)AgNWs 0.24 mg/cm2(d)AgNWs 0.36 mg/cm2 比例尺：50μmFig 5 Human fibroblast morphology: (a) TCPs contrast; (b) AgNWs 0.12; (c) AgNWs 0.24; (d) AgNWs 0.36. scale bar: 50 μm

3 結(jié)論

研究通過多元醇還原法制備了長度在5～10 μm，長徑比在50～100的AgNWs，并利用聚四氟乙烯凹槽模具，采用噴涂法制備了AgNWs含量分別為0.12、0.24、0.36 mg/cm2的AgNWs/PDMS薄膜并對其進(jìn)行了抗菌性實(shí)驗(yàn)、30天銀含量釋放測定實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞毒性試驗(yàn)，得到如下結(jié)論：

(1)含AgNWs的AgNWs/PDMS薄膜對E.coli、S.aureus、PAO1幾種常見致病菌具有顯著的抗菌性能，并隨著AgNWs含量的增加而提升。

(2)3種不同AgNWs含量的AgNWs/PDMS薄膜對人真皮成纖維細(xì)胞形態(tài)不會造成明顯影響，也并未造成明顯的細(xì)胞死亡現(xiàn)象。

(3)薄膜在生理鹽水中的銀含量釋放符合突釋規(guī)律，其起始的1-2天累積釋放率在80%以上，累積銀濃度在不產(chǎn)生細(xì)胞毒性的(0～1)級安全范圍內(nèi)，可以滿足其用于人皮膚表面相關(guān)醫(yī)療材料的用途。