谷敏婧，趙飛翔，范蘇娜, 2，馬 凱，姚 響，張耀鵬, 2

(1. 東華大學(xué) 纖維材料改性國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620；2. 濟(jì)南金泉生物科技有限公司，濟(jì)南 250101； 3. 襄陽市中醫(yī)醫(yī)院下肢骨科，湖北 襄陽 441000)

0 引 言

骨是一種致密的締結(jié)組織，在生命活動(dòng)中起著重要的作用。正常情況下，骨組織有一定的再生和自我修復(fù)能力，但是由于嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除等造成的骨缺損則只能采用骨移植的方法加以修復(fù)[1]。目前采用的移植技術(shù)存在諸多不足，如二次創(chuàng)傷、并發(fā)炎癥、免疫排斥、成骨能力有限等問題[2-3]，而骨組織工程技術(shù)的發(fā)展為骨修復(fù)提供了一種新的治療途徑。已有研究報(bào)道表明多種材料均可用于骨組織工程支架[4]，其中絲素蛋白(SF)由于其具有優(yōu)異的生物相容性、可控的降解性、無免疫源性、優(yōu)良的加工性等，成為了組織工程支架的理想材料之一[5-8]。然而，研究表明純SF支架在力學(xué)性能方面難以匹配骨組織工程的要求[9-10]。細(xì)菌纖維素納米纖維束(BCNR)具有良好的生物相容性和優(yōu)異的機(jī)械性能，將其作為增強(qiáng)材料與SF復(fù)合，可進(jìn)一步提升支架的力學(xué)性能和孔徑尺寸[11-12]。羥基磷灰石是骨組織中主要的無機(jī)成份，而納米羥基磷灰石(nHAp)的組成、晶型和結(jié)晶度與天然骨中的羥基磷灰石極其相似，同時(shí)還具有較高的比表面積、生物相容性、骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)活性等[13-14]。因此，以SF材料為基體，加入BCNR和nHAp，有望制備出結(jié)構(gòu)組成和力學(xué)性能均能滿足使用要求的骨仿生組織工程支架。冷凍干燥法操作簡便，可較好地保留原料組份的生物活性和力學(xué)性能，再水化后支架也能較好地保持其結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度[15]。因此，本文以SF為基體，BCNR為增強(qiáng)材料，輔以骨活性成份nHAp復(fù)合，通過冷凍干燥法制備骨仿生支架，分析了復(fù)合支架的微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率、力學(xué)性能、吸水率等性能，驗(yàn)證了細(xì)胞在支架上的黏附和增殖能力。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料及設(shè)備

家蠶繭，浙江桐鄉(xiāng)；細(xì)菌纖維素，海南椰國食品有限公司；納米羥基磷灰石，美國Sigma公司；無水碳酸鈉，分析純，國藥集團(tuán)有限公司；溴化鋰，分析純，上海中鋰實(shí)業(yè)有限公司；透析袋，截留分子量(14 000 ± 2 000)，上海源聚生物科技有限公司；DMEM低糖培養(yǎng)液，美國Gibco公司；胎牛血清，美國Gibco公司；三抗(青霉素、鏈霉素、兩性霉素B)，美國Gibco公司；CCK-8試劑盒，日本Dojindo公司。

冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)D-1A-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀(FTIR)，Nicolet 6700，美國Thermo Fisher公司；掃描電子顯微鏡(SEM)，Quanta 250，美國FEI公司；電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)，Instron 5969，美國英斯特朗公司；恒溫 CO2培養(yǎng)箱，BB15，德國Heraeus公司；超凈工作臺(tái)，BJ-CD Series，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；酶標(biāo)儀，Multiskan MK3，美國Thermo公司。

1.2 SF/BCNR/nHAp骨仿生支架的制備

SF水溶液和BCNR的制備過程參照文獻(xiàn)[16]。本文固定兩者的質(zhì)量比為SF：BCNR=20：3，改變nHAp組份的含量，使其占復(fù)合體系總固含量的比例分別為0、20%、30%、40%，所制備的復(fù)合支架(composite scaffold，CS)分別簡稱為CS0、CS20、CS30、CS40。具體步驟為先將nHAp加入到12 wt%的SF溶液中，隨后用磁力攪拌器攪拌均勻，再加入BCNR，繼續(xù)攪拌，將混合均勻的原料倒入模具中(直徑為18 mm，高度為8 mm的圓柱體)成型，放置在-25 ℃下冷卻處理12 h，再置于-80 ℃條件下冷凍12 h，最后通過冷凍干燥機(jī)將樣品凍干。

1.3 支架性能表征

SEM：將制備好的樣品干燥后噴金(電流為10 mA，時(shí)間為50 s),在10 kV的電壓下觀察支架的微觀結(jié)構(gòu)。支架的片層厚度和間距由Image J軟件進(jìn)行測(cè)量分析，單個(gè)樣品的數(shù)據(jù)來源于100處測(cè)量。

FTIR：將干燥后的支架樣品放在研缽中磨碎，再加入溴化鉀繼續(xù)研磨，混合均勻后用磨具壓成薄片，采用壓片法進(jìn)行測(cè)試。掃描的波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16。使用PeakFit軟件對(duì)紅外光譜的酰胺I區(qū)進(jìn)行分峰擬合，計(jì)算各支架的無規(guī)卷曲/螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量。

電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)：樣品尺寸：直徑為18 mm，高為10 mm。試驗(yàn)機(jī)上裝載10 kN的傳感器，以3 mm/min的速率進(jìn)行壓縮。選取所得的應(yīng)力-應(yīng)變曲線中應(yīng)變?yōu)?0%處的強(qiáng)度作為支架的壓縮強(qiáng)度；支架的彈性模量由應(yīng)力-應(yīng)變曲線初始直線部分的斜率得到。

孔隙率測(cè)試：將支架樣品干燥后稱重，并計(jì)算樣品體積，從而計(jì)算出樣品的表觀密度ρa(bǔ)；通過密度儀測(cè)試樣品的實(shí)際密度ρr，通過以下公式計(jì)算支架的孔隙率：

(1)

溶脹率測(cè)試：將支架樣品干燥后稱重，記為Wdry，再將各樣品用PBS浸泡，在37 ℃下放置24 h后取出，用濾紙吸干支架表面多余的水分，稱重，記為Wwet。溶脹率通過以下公式計(jì)算：

(2)

1.4 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和接種

按照2×104cells/cm2的密度將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿(直徑為10 cm)中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，每皿添加10 mL的培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液組成如下：500 mL的DMEM低糖培養(yǎng)液、50 mL的胎牛血清和5.5 mL的三抗混合而成。放在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天全量更換培養(yǎng)液。細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿80%左右后收集制成細(xì)胞懸浮液，選取CS0和CS30為代表性支架材料，將細(xì)胞接種到經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的CS0和CS30復(fù)合支架上(1×106cells/支架)，隨后將已接種細(xì)胞的支架放到6孔板中(每孔放置1個(gè)支架)，放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，每孔加入6 mL細(xì)胞培養(yǎng)液后放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每兩天全量更換一次培養(yǎng)液。

1.5 典型支架材料中的細(xì)胞活力檢測(cè)

按照CCK-8試劑在細(xì)胞培養(yǎng)液中體積比為10%的比例配置CCK-8檢測(cè)液，將接種細(xì)胞后培養(yǎng)1天和7天的支架樣品(CS0和CS30)取出放入24孔板中，每孔加入1 mL已配好的CCK-8檢測(cè)液，放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，再將孵育完成的CCK-8溶液部分轉(zhuǎn)移至96孔板，每孔100 μL，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，通過Origin中的one-way ANOVA檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否具有顯著性差異，p < 0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同nHAp含量對(duì)復(fù)合支架微觀孔隙結(jié)構(gòu)的影響

支架中孔的幾何特征，包括孔的形態(tài)、孔徑、孔隙率、互通性等，是影響組織工程中細(xì)胞黏附、遷移、增殖以及營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹匾蛩豙17]。本文采用SEM表征復(fù)合支架的形貌結(jié)構(gòu)。由圖1(a)可知，SF/BCNR二元復(fù)合支架(CS0)具有明顯的骨仿生片層結(jié)構(gòu)，其中SF作為主體材料，形成骨架片層；BCNR部分貼附在片層表面，部分穿插在片層之間，以增加片層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及支架的機(jī)械強(qiáng)度，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道較為吻合[16]。為進(jìn)一步提升支架的仿生性能，本文構(gòu)建了SF/BCNR/nHAp三元復(fù)合骨支架。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，nHAp的負(fù)載并不會(huì)阻礙或破壞骨仿生片層結(jié)構(gòu)，如圖1(a)所示。同時(shí)，nHAp顆粒的存在使支架表面更粗糙，理論上將更利于細(xì)胞的黏附。對(duì)支架的片層結(jié)構(gòu)進(jìn)行半定量表征，取距支架中心4 mm的位置計(jì)算骨仿生支架的片層間距和片層厚度，測(cè)量結(jié)果如圖1(b)所示，隨nHAp負(fù)載量的增加，片層間距明顯增大，從(22.39±6.89)μm(CS0)增大到(72.83±28.14)μm(CS40)，其原因可能是由于nHAp部分穿插在片層間所致。此外，負(fù)載nHAp的三元復(fù)合支架的孔隙率較SF/BCNR二元復(fù)合支架也有明顯提升，在CS30和CS40支架中可達(dá)到85%，如圖1(c)所示。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，三元復(fù)合支架和二元復(fù)合支架的孔隙率存在顯著性差異。上述結(jié)果表明，具有骨活性nHAp組份的負(fù)載不會(huì)阻礙或破壞骨仿生片層結(jié)構(gòu)的形成，還可增大片層間距、提升支架孔隙率和表面粗糙度。SF/BCNR/nHAp三元復(fù)合進(jìn)一步提升了骨支架在結(jié)構(gòu)和活性上的仿生程度，有利于促進(jìn)骨組織的修復(fù)和再生能力。

圖1 不同nHAp含量SF/BCNR/nHAp復(fù)合支架的微觀孔隙結(jié)構(gòu)(a)SEM圖，(b)片層厚度和間距，(c)孔隙率(*代表數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異，n=3，p<0.05)Fig 1 Microscopic pore structure of SF/BCNR/nHAp composite scaffolds with different nHAp contents: (a) SEM images; (b) Lamellar thickness and interlamellar gap; (c) porosity (* represents the significant difference between the date, n = 3, p < 0.05)

2.2 不同nHAp含量對(duì)復(fù)合支架二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖2 不同nHAp含量SF/BCNR/nHAp復(fù)合支架的紅外光譜圖(a)紅外光譜圖，(b)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(*代表數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異，n=3，p<0.05)Fig 2 FTIR spectra of SF/BCNR/nHAp composite scaffolds with different nHAp contents (a)FTIR spectra; (b) secondary structure analysis (* represents the significant difference between the date, n=3, p< 0.05)

2.3 不同nHAp含量對(duì)復(fù)合支架力學(xué)性能的影響

為滿足骨組織修復(fù)的要求，理想的仿生支架材料還需具有完全匹配的力學(xué)性能。在本研究中，未添加nHAp時(shí)，SF/BCNR二元復(fù)合支架CS0的壓縮強(qiáng)度為(2.69±0.22)MPa；添加nHAp后，SF/BCNR/nHAp三元復(fù)合支架的壓縮強(qiáng)度先降低后增加，隨后再降低，且CS0和CS20、CS40的壓縮強(qiáng)度具有顯著性差異，如圖3(a)所示。當(dāng)nHAp的含量為30%時(shí)，支架的壓縮強(qiáng)度為(2.08±0.23)MPa，與CS0無顯著性差異，依然在與松質(zhì)骨匹配的壓縮強(qiáng)度(2～12 MPa)范圍內(nèi)[20]。另一方面，SF/BCNR/nHAp三元復(fù)合支架的彈性模量隨nHAp的添加先增加后減小，如圖3(b)所示。其中CS30的彈性模量最高，為(26.56±2.16)MPa。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因很可能是nHAp的添加使得支架的片層間距增大，進(jìn)而導(dǎo)致抵抗壓縮的能力降低；但由于nHAp納米顆粒自身的支撐作用，支架的彈性模量先有所增加，在30%左右達(dá)到峰值，隨著含量的進(jìn)一步增加(40%)，過量的nHAp可能導(dǎo)致納米顆粒聚集，使復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)不均勻，進(jìn)而導(dǎo)致支架的彈性模量和壓縮強(qiáng)度都有明顯降低，這與Farokhi等人文獻(xiàn)中nHAp含量的過度增加導(dǎo)致納米顆粒聚集，進(jìn)而導(dǎo)致SF/nHAp支架力學(xué)性能降低的報(bào)道較為一致[14]。同時(shí)，有研究表明細(xì)胞的生長分化能力與組織工程支架的力學(xué)性能有密切關(guān)系，與骨組織匹配的力學(xué)性能可促進(jìn)骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)[21-23]。綜合各項(xiàng)力學(xué)性能參數(shù)，在SF/BCNR/nHAp三元復(fù)合支架中，CS30更能匹配松質(zhì)骨的力學(xué)性能要求。

圖3 不同nHAp含量SF/BCNR/nHAp復(fù)合支架的力學(xué)性能(a)壓縮強(qiáng)度，(b)彈性模量(*代表數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異，n=3，p<0.05)Fig 3 Mechanical properties of SF/BCNR/nHAp composite scaffolds with different nHAp contents: (a) compressive strength; (b) elastic modulus (* represents the significant difference between the date, n=3, p<0.05)

2.4 不同nHAp含量對(duì)復(fù)合支架溶脹率的影響

骨缺損的修復(fù)效果還依賴于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物在組織工程支架中的傳輸和交換效率。由圖4可知，加入nHAp后，SF/BCNR/nHAp三元復(fù)合支架的溶脹率有一定程度的提升，但各復(fù)合支架的溶脹率并無顯著性差異?？赡茉蛟谟趎HAp的負(fù)載增大了支架的孔徑和孔隙率，如圖1(b)、(c)所示，進(jìn)而使得其可容納的水分子增多，連通性增強(qiáng)，從而使溶脹率的平均值有一定提升。高的溶脹率利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的輸送，從而利于細(xì)胞的黏附和生長[24]。由此可見，負(fù)載nHAp的三元復(fù)合支架有望更利于細(xì)胞的黏附和生長，SF/BCNR/nHAp三元復(fù)合支架CS30具有最優(yōu)的骨組織仿生性能。

2.5 nHAp的負(fù)載對(duì)復(fù)合支架上細(xì)胞黏附和增殖能力的影響

支架材料在體外的細(xì)胞黏附和增殖能力評(píng)估能夠間接反映其在體內(nèi)對(duì)缺損組織的修復(fù)潛能。CCK-8試劑盒可簡便準(zhǔn)確地檢測(cè)支架材料上的細(xì)胞活力(同時(shí)可間接反映相對(duì)細(xì)胞數(shù)量)。典型支架材料(CS0和CS30)上細(xì)胞活力的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，從1天的結(jié)果來看，與CS0相比，CS30上的細(xì)胞活力更強(qiáng)，CS0的OD值與CS30的值存在顯著性差異，表明SF/BCNR/nHAp三元復(fù)合支架更利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的初始黏附。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(7天)，相對(duì)細(xì)胞活力(OD值)明顯增大，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在兩種復(fù)合支架上都有明顯的增殖，但CS30上的細(xì)胞活力明顯更強(qiáng)，OD值存在顯著性差異。與SF/BCNR二元復(fù)合支架CS0相比，SF/BCNR/nHAp三元復(fù)合支架CS30更有利于細(xì)胞的初始黏附及后續(xù)的細(xì)胞增殖。該結(jié)果證實(shí)了具有骨活性成份nHAp的引入提高了支架上干細(xì)胞的黏附和增殖能力，進(jìn)一步提升了三元復(fù)合支架的細(xì)胞相容性，展現(xiàn)了SF/BCNR/ nHAp三元復(fù)合骨仿生支架在骨組織修復(fù)方面的潛力。

圖5 細(xì)胞在CS0和CS30復(fù)合支架上的細(xì)胞活力評(píng)估(*代表數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異，n=3，p< 0.05)Fig 5 Cell viability assessment of cells on the composite scaffolds of CS0 and CS30 (* represents the significant difference between the date, n=3, p<0.05)

3 結(jié) 論

(1)在SF/BCNR二元復(fù)合支架的基礎(chǔ)上，骨活性成份nHAp的負(fù)載并未阻礙或破壞支架中骨仿生片層結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)支架中SF的二級(jí)結(jié)構(gòu)也無明顯影響，但增大了SF/BCNR/nHAp三元復(fù)合支架的孔徑、孔隙率和溶脹率，提升了三元復(fù)合支架的仿生程度。

(2)適量nHAp(30%)的加入使三元復(fù)合支架CS30的壓縮強(qiáng)度和彈性模量等力學(xué)性能能夠更好地匹配松質(zhì)骨的力學(xué)性能要求。

(3)與SF/BCNR二元復(fù)合支架相比，骨活性成份nHAp的加入明顯提高了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在SF/BCNR/nHAp三元復(fù)合支架上的黏附和增殖能力，體現(xiàn)了該支架在骨組織修復(fù)方面的潛力。