李廣波，軒乾坤，羽曉瑜，溫冬華，楊思敏

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200123)

乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)是經(jīng)血液傳播的主要病原體，其感染亦是目前較為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。醫(yī)療單位常將這3種病原體和梅毒作為有創(chuàng)診療和輸血前常規(guī)檢測(cè)的病原體。目前常用ELSIA或電化學(xué)發(fā)光等檢測(cè)這些病原體的抗原或抗體。新發(fā)感染后抗原或抗體的檢測(cè)需要較長(zhǎng)的窗口期，而病原體核酸檢測(cè)可明顯縮短窗口期。文獻(xiàn)報(bào)道HIV感染后1～2周(平均11 d)可檢測(cè)到HIV RNA，3～4周(平均22 d)可檢測(cè)到抗HIV；HCV感染后1～2周(平均12 d)可檢測(cè)到HCV RNA，2～3個(gè)月(平均70 d)可檢測(cè)出抗HCV；HBV感染后最早33 d可檢測(cè)出HBV DNA，2個(gè)月(平均56 d)可檢測(cè)出HBsAg[1]。因此病毒核酸檢測(cè)可明顯提前確認(rèn)患者的感染狀態(tài)，能有效控制傳染病，預(yù)防疾病傳播的發(fā)生。目前醫(yī)院很少將核酸檢測(cè)應(yīng)用于手術(shù)前和輸血前篩查，本文探討核酸檢測(cè)在血液傳染病篩查的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018-2019年在本院住院因手術(shù)或輸血需要檢測(cè)乙肝五項(xiàng)和抗HCV、HIV抗原抗體的500例患者血清標(biāo)本。分離血清，留取1.5 mL做核酸檢測(cè)，其余用于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)抗原抗體。

1.2 方法

1.2.1核酸篩查檢測(cè)下限驗(yàn)證

陰性血清將WHO標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(HBV：NIBSC code10/266，HCV：NIBSC code 14/150，HIV：NIBSC code 16/194)稀釋到試劑說明書注明的檢出限濃度，即HBV DNA 5 IU/mL、HCV RNA 50 IU/mL、HIV RNA 50 IU/mL。每批試驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)4次，重復(fù)檢測(cè)5批，分別統(tǒng)計(jì)5批試驗(yàn)樣品陽性檢出率，陽性樣品統(tǒng)計(jì)CT值的CV值，陽性檢出率大于或等于90%，CT值CV<5%為驗(yàn)證通過。

1.2.2病毒抗原抗體檢測(cè)

使用羅氏cobas e602免疫化學(xué)發(fā)光儀及羅氏配套試劑檢測(cè)患者血清乙肝五項(xiàng)，抗HCV、HIV抗原抗體。

1.2.3病毒核酸定性檢測(cè)

使用上?？迫A公司的HBV、HCV、HIV(1型)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光法)的提取試劑盒和擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒。使用HAMILTON的MICROLAB STAR核酸提取儀提取核酸，伯樂CFX Connet PCR儀定性檢測(cè)HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按照試劑盒說明書。

1.2.4病毒核酸定量檢測(cè)

比對(duì)每份樣品HBsAg、抗 HCV、HIV抗原抗體的結(jié)果與核酸定性檢測(cè)結(jié)果是否一致。結(jié)果不一致的原始標(biāo)本使用羅氏COBASAmpliPrep-COBAS TaqMan(CAP-CTM)系統(tǒng)定量檢測(cè)核酸水平。

2 結(jié) 果

2.1 檢測(cè)下限驗(yàn)證

HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA檢測(cè)下限分別為5 IU/mL、50 IU/mL、50 IU/mL，見表1。

表1 檢測(cè)下限驗(yàn)證結(jié)果

2.2 化學(xué)發(fā)光和核酸檢測(cè)結(jié)果比較

檢測(cè)出11例HBV化學(xué)發(fā)光與核酸定性結(jié)果不一致標(biāo)本，未檢出HCV、HIV化學(xué)發(fā)光與核酸定性結(jié)果不一致標(biāo)本，見表2。

表2 化學(xué)發(fā)光和核酸檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)

2例HBsAg陽性HBV DNA篩查陰性標(biāo)本，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)顯示HBV DNA定量小于檢測(cè)限。9例(1.8%)HBsAg陰性HBV DNA篩查陽性標(biāo)本，1例定量為23.6 IU/mL,6例可見擴(kuò)增曲線定量小于檢測(cè)限，2例無擴(kuò)增曲線，見表3。

續(xù)表2 化學(xué)發(fā)光和核酸檢測(cè)結(jié)果比較

表3 乙肝五項(xiàng)、HBV DNA定性及定量結(jié)果

3 討 論

目前臨床常用化學(xué)發(fā)光或ELISA方法檢測(cè)乙肝五項(xiàng)、抗HCV、HIV抗原抗體確認(rèn)患者的感染情況。因病毒復(fù)制周期及感染者免疫狀態(tài)個(gè)體差異，從感染到檢測(cè)陽性存在長(zhǎng)短不一的窗口期。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，有效利用PCR的高靈敏度和高特異性，可大大縮短窗口期。目前HBV DNA和HCV RNA定量檢測(cè)在臨床已廣泛應(yīng)用，但其檢測(cè)下限較高，常見試劑檢測(cè)下限HBV DNA 為100 IU/mL，HCV RNA為1 000 IU/mL，可用于治療監(jiān)測(cè)，但不適合常規(guī)感染篩查。HIV RNA定量或定性檢測(cè)未普遍應(yīng)用于臨床。本研究定性檢測(cè)下限HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA分別為5、50、50 IU/mL，較定量檢測(cè)大幅降低，這種極低的檢測(cè)下限能更好地檢測(cè)處于窗口期和低拷貝感染者。

本研究共檢測(cè)500例血清標(biāo)本，共檢測(cè)出HBsAg陰性HBV DNA篩檢陽性9例(1.8%)，遠(yuǎn)高于血站檢測(cè)的陽性率。上海地區(qū)的HBsAg陰性獻(xiàn)血人群中HBV DNA陽性感染率為0.049%[2]，北京地區(qū)無償獻(xiàn)血者感染率為0.05%[3]，閩南地區(qū)同類研究報(bào)道為0.2%[4]。其原因可能為研究對(duì)象不同，本研究樣本量較小，地區(qū)人群HBsAg流行差異及檢測(cè)HBsAg和HBV DNA所采用的檢測(cè)試劑不同。獻(xiàn)血者多為身體健康的青年人，本研究患者多為重病需要手術(shù)或輸血的中老年患者。HCV RNA和HIV RNA未檢出陽性樣品，與這兩種病原體在人群中的流行率較低及本試驗(yàn)檢測(cè)樣品數(shù)量較少有關(guān)。目前公認(rèn)的HBV DNA定量檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”是羅氏公司COBASAmpliPrep-COBAS TaqMan(CAP-CTM)定量檢測(cè)系統(tǒng)，其檢測(cè)下限為20 IU/mL。本研究檢出1例23.6 IU/mL標(biāo)本，8例可見擴(kuò)增曲線但定量低于20 IU/mL。2例HBsAg陽性HBV DNA定性陰性標(biāo)本可見擴(kuò)增曲線但定量低于20 IU/mL，分析原因可能為定性檢測(cè)下限(5 IU/mL)附近的低拷貝樣品。HBsAg陰性HBV定量檢測(cè)陽性的7例標(biāo)本中1例乙肝五項(xiàng)全部陰性疑似HBV感染窗口期，其余6例為HBsAb、HBeAb、HBcAb中1項(xiàng)或多項(xiàng)陽性的多種不同組合，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[5-6]。若HBV患者和無癥狀攜帶者血清中HBsAg檢測(cè)結(jié)果呈陰性，而血清或肝臟中HBV DNA檢測(cè)結(jié)果呈陽性，被稱為隱匿性HBV感染(occult HBV infection，OBI)[7-8]。本研究中低于定量檢測(cè)下限(20 IU/mL)的6例患者疑似為OBI，1例患者(5號(hào)病例)為疑似窗口期感染，但并未進(jìn)一步追蹤并確認(rèn)。

手術(shù)因有創(chuàng)操作等可能增加患者院內(nèi)感染HBV、HCV、HIV的風(fēng)險(xiǎn)，臨床通常要求手術(shù)或輸血患者輸血前檢測(cè)乙肝五項(xiàng)、抗HCV、HIV抗原抗體以避免不必要的醫(yī)療糾紛，評(píng)估對(duì)患者實(shí)施創(chuàng)傷操作醫(yī)務(wù)人員感染的風(fēng)險(xiǎn)。醫(yī)務(wù)工作者發(fā)生職業(yè)暴露后可根據(jù)暴露源病毒核酸檢測(cè)結(jié)果評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，為緊急藥物處理等提供更準(zhǔn)確而及時(shí)快速的支持。研究表明我國(guó)1～59歲普通人群HBsAg陽性率為 7.18%[9]。血液透析人群由于經(jīng)常暴露在血液環(huán)境、頻繁穿刺、共用透析設(shè)備及免疫力降低等原因，成為HBV感染的高危人群，我國(guó)血液透析人群 HBsAg 陽性率為11.9%，遠(yuǎn)高于普通人群[10-11]。HBV、HCV、HIV病原體核酸檢測(cè)的高靈敏度和避開窗口期為透析患者的分區(qū)隔離管理提供了有力保障。1996-2016年國(guó)內(nèi)有關(guān)HCV感染暴發(fā)事件的文獻(xiàn)報(bào)道因血液透析發(fā)生 HCV 感染暴發(fā)事件10起，不安全注射導(dǎo)致HCV感染暴發(fā)事件3起，輸血或單采血漿導(dǎo)致 HCV 感染暴發(fā)事件4起[12]。抗HCV檢測(cè)是目前國(guó)內(nèi)篩查HCV感染的主要方法，在臨床工作中，通常對(duì)抗HCV篩查陽性者才進(jìn)行HCV RNA檢測(cè)，很大程度上可能漏檢了一部分處于血清轉(zhuǎn)換期的HCV感染者，而給其他透析患者帶來了很大的風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。HBV、HCV、HIV病原體核酸檢測(cè)可縮短窗口期，減少此類不良事件的發(fā)生。

臨床醫(yī)生可根據(jù)實(shí)際需求選擇各有優(yōu)缺點(diǎn)的血清學(xué)和核酸檢測(cè)篩查血液傳染病，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，還原患者病原體感染的真實(shí)狀況，有助于疾病診斷、病情監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)、判斷預(yù)后，有利于評(píng)估有創(chuàng)操作職業(yè)暴露的風(fēng)險(xiǎn)。