駱佳銘，李 機，趙 偉

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院麻醉科，廣州 510282)

心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是圍術(shù)期面臨的一種常見病理生理變化，嚴(yán)重威脅患者生命安全[1-2]，其發(fā)病機制仍不清楚。前期研究表明MIRI是多種因素共同作用的結(jié)果[3-4]，在急性心肌缺血再灌注狀態(tài)中氧化應(yīng)激發(fā)揮了顯著破壞作用[5-6]。當(dāng)發(fā)生心肌缺血再灌注時，活性氧(reactive oxygen species,ROS)暴發(fā)超過了機體捕獲清除的能力時可破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，造成MIRI。氧化應(yīng)激是如何導(dǎo)致MIRI后心肌細(xì)胞損傷和死亡，至今尚不明確。

相關(guān)研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的重要因素之一[7]。DNA 作為生物體最重要的遺傳物質(zhì)，其穩(wěn)定性決定了生物的生存和發(fā)展。但生物體本身基因的完整性容易受內(nèi)、外環(huán)境因素影響，輻射線的傷害或化學(xué)試劑的破壞均可導(dǎo)致DNA 的雙鍵結(jié)構(gòu)斷裂而造成損傷。前期研究發(fā)現(xiàn)，MIRI過程中心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高[6,8-9]。由此推測，MIRI病理過程中氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS很可能是導(dǎo)致心肌細(xì)胞DNA損傷的重要因素。

本研究在大鼠心肌H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型上檢測細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷，并通過加入抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)論證由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷在MIRI發(fā)病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌H9C2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫(目錄號GNR 5)；一抗Bcl-2(貨號：#3498)、Bax(貨號：#1479)、Cytochrome c(貨號：#12963)、Phospho-Histone H2A.X (S139)(貨號：#9718S)和β-actin(貨號：#4967)抗體購自美國CST公司；8-OHdG(貨號：#sc-66036)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠心肌H9C2細(xì)胞是來源于胚胎期BD1X大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系，由于來源于心臟，常作為心臟成肌細(xì)胞用于心肌疾病的研究。將H9C2細(xì)胞置于含有10% FBS 100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃ 5% CO2細(xì)胞孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液每 2天換1次[10]。

1.2.2建模和分組

將正常培養(yǎng)的 H9C2細(xì)胞分成4組。對照組(Con組)：37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)；缺氧/復(fù)氧模型組(H/R組)：在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液，細(xì)胞長至80%后將細(xì)胞用PBS沖洗，加入不含血清的低糖DMEM，置入85%N2、10%H2、5%CO2的37%飽和濕度厭氧培養(yǎng)箱，分別缺氧培養(yǎng)6 h，加入新鮮DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)復(fù)氧培養(yǎng)12 h[11]；抗氧化劑NAC組(NAC組)：僅在培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L抗氧化劑NAC，不進行缺氧/復(fù)氧處理[12]；抗氧化劑+模型組(NAC+H/R組)：缺氧/復(fù)氧前1 h在培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L抗氧化劑NAC預(yù)處理，再進行缺氧/復(fù)氧處理。

1.2.3Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達

取各組處理后的H9C2細(xì)胞，以預(yù)冷的 PBS洗滌 3次后加入100 μL含10% PMSF和5%磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液(使用前5 min 配置)，低溫離心取蛋白上清液后進行蛋白定量；上樣后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳完成后再用200 mA恒定電流進行0.22 μm PVDF轉(zhuǎn)膜90 min，封閉2 h，繼續(xù)孵一抗過夜，TBST緩沖液清洗 3次，室溫下孵二抗1 h，TBST清洗3次，化學(xué)發(fā)光儀進行檢測。Image J軟件分析照片中蛋白條帶的吸光度(A)值，計算目的蛋白相對表達水平。

1.2.4細(xì)胞免疫熒光檢測ROS水平、DNA損傷、細(xì)胞損傷情況[13]

H9C2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板的細(xì)胞爬片上。各組處理后，PBS漂洗2次,10 mmol/L的DCFH-DA染液于37 ℃孵育30 min，DAPI 37 ℃復(fù)染細(xì)胞核10 min。隨機選取5個視野用熒光顯微鏡采集照片。

經(jīng)過分組處理后，PBS清洗細(xì)胞爬片3次，4%的多聚甲醛的固定10 min，放入含0.1% Triton X-100的PBS中室溫孵育15 min。PBS清洗3次，分別加入目的抗體4 ℃過夜；次日PBS清洗3次，分別采用對應(yīng)熒光二抗室溫孵育1 h，PBS 清洗3次，加入1 μg/mL DAPI 37 ℃復(fù)染細(xì)胞核10 min；加抗淬滅封片劑蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。Image J軟件分析各樣品的平均熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激ROS水平

與Con組比較，H/R組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高(P<0.05)；與H/R組比較，NAC+H/R組ROS水平明顯降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞ROS水平

2.2 各組DNA損傷、細(xì)胞損傷情況

與Con組比較，H/R組細(xì)胞p-γH2ax、8-OHdG、Cytochrome c表達增多(P<0.05)；與H/R組比較，NAC+H/R組細(xì)胞p-γH2ax、8-OHdG、Cytochrome c表達明顯降低(P<0.05)，見圖2、3。

A:各組熒光顯示圖；B:p-γH2ax；C：8-OHdG。

圖3 各組細(xì)胞損傷情況

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況

與Con組比較，H/R組細(xì)胞Bax/Bcl-2表達增加(P<0.05)；與H/R組比較，NAC+H/R組細(xì)胞Bax/Bcl-2表達減少(P<0.05)，見圖4。

A:Western blot；B:Bax/Bcl-2。

3 討 論

MIRI是多種因素共同作用的結(jié)果，當(dāng)發(fā)生心肌缺血再灌注時，ROS通過心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的一系列相互作用途徑暴發(fā)性產(chǎn)生[14]，并成為缺血后損傷的關(guān)鍵機制。當(dāng)心肌發(fā)生缺血或梗死時，細(xì)胞內(nèi)氧自由基的形成增加，同時抗氧化系統(tǒng)受到限制，O2-和H2O2的清除減少，使氧自由基轉(zhuǎn)變成最強的-HO，超過了機體捕獲清除的能力[15]。ROS可攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，破壞心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，最終造成MIRI。另外，氧化應(yīng)激可通過上調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2來引發(fā)細(xì)胞損傷?？梢娧趸瘧?yīng)激在心肌細(xì)胞凋亡和損傷過程中起著至關(guān)重要的作用，它們參與了MIRI的發(fā)病機制。因此，ROS的產(chǎn)生是決定心肌損傷嚴(yán)重程度的重要因素。

DNA 作為生物體最重要的遺傳物質(zhì)，對正常情況下不可再生的心肌細(xì)胞來講尤為重要[15]。相關(guān)研究表明：氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的重要因素之一[16]。MIRI過程中ROS產(chǎn)生過多或 DNA損傷未能修復(fù)，將對心肌造成不可逆的損傷[17]。此外，既往研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機體發(fā)生DNA損傷后會激活細(xì)胞周期“防火墻”，可暫時阻滯細(xì)胞周期的進展，而且還會激活相關(guān)的修復(fù)通路對損傷的DNA進行修復(fù)，如果DNA損傷無法完全被修復(fù)，則會引起細(xì)胞凋亡甚至壞死[18]。本研究顯示，大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)過缺氧/復(fù)氧處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，DNA損傷明顯加重，凋亡增多。而之前的研究也有類似報道，MIRI病理過程中氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS很可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞的DNA 損傷[19]。

因此，尋找一個心臟保護劑和抗氧化劑來調(diào)節(jié)ROS水平進行預(yù)處理，對改善心臟功能和延緩心肌壞死具有重要的臨床意義[4,6]。最近，基礎(chǔ)研究提供了心肌缺血和再灌注期間ROS形成的直接證據(jù)，一些臨床前和臨床研究也已經(jīng)證明抗氧化劑的潛在心臟保護價值[20-22]。NAC作為一種含有巰基的抗氧化劑，它能干擾ROS、清除自由基。有研究報道NAC可通過減少自由基的產(chǎn)生，拮抗 ROS介導(dǎo)的大鼠 H9C2心肌細(xì)胞凋亡[23]，與本研究結(jié)果一致。臨床上，NAC是極具研究價值且用途廣泛的藥物，其在治療慢性肝損害、呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退行性疾病、艾滋病和心功能損傷等疾病方面均取得了較好的療效。然而，NAC是一種非特異性的抗氧化劑，它不能針對性地降低具有破壞性的氧化因素，甚至可能干預(yù)到正常的生理水平的氧化功能。筆者加入終濃度為1 mmol/L抗氧化劑NAC，結(jié)果顯示NAC組與Con組細(xì)胞內(nèi)ROS水平、DNA損傷均無明顯差異。如果明確加重MIRI過程中氧化應(yīng)激的種類，進行有針對地干預(yù)清除而保留生理功能的氧化水平將會極大地發(fā)揮該類抗氧化劑的治療效果[4]，后續(xù)研究將以此為側(cè)重點。

綜上所述,氧化應(yīng)激介導(dǎo)的DNA損傷可能密切參與MIRI的發(fā)病過程，抗氧化劑NAC可明顯減少氧化應(yīng)激心肌細(xì)胞的DNA損傷和凋亡，從而減輕MIRI。