浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院（310003）彭會(huì)貞

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度后進(jìn)行切片的方法[1]。術(shù)中冰凍病理檢查可確定腫瘤性質(zhì)，確定淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移等，由于術(shù)中冰凍技術(shù)的局限性，以及某些腫瘤細(xì)胞HE染色形態(tài)上的相似性，導(dǎo)致單靠術(shù)中冰凍組織HE染色明確診斷困難較大，易漏診誤診，造成患者的二次手術(shù)或醫(yī)療事故等[2]。免疫組化染色主要用于對(duì)不同組織來(lái)源腫瘤的鑒別診斷，快速免疫組化應(yīng)用于術(shù)中冰凍，彌補(bǔ)了冰凍病理檢查的不足。但是冰凍切片免疫組化技術(shù)還不是很成熟，實(shí)驗(yàn)流程一直在優(yōu)化，由于冰凍組織是新鮮的，在快速免疫組化的實(shí)驗(yàn)步驟中，冰凍切片很容易脫片，作者經(jīng)過(guò)反復(fù)的實(shí)驗(yàn)，摸索出冰凍切片免疫組化不脫片的條件，實(shí)驗(yàn)的流程如下。

1 材料

標(biāo)本來(lái)自于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科的術(shù)中冰凍標(biāo)本，標(biāo)本類型是肺、甲狀腺、腎、闌尾等；一抗是細(xì)胞角蛋白CK，克隆號(hào)是AE1/AE3，購(gòu)自中杉金橋；二抗是酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物，購(gòu)自中衫金橋；阻斷劑是H2O2和甲醇1∶1的混合物；DAB購(gòu)自leica公司；Buffer緩沖液購(gòu)自Roche公司；載玻片選用石蠟切片免疫組化專用的TOMO（IHC Adhesive Glass Slide）載玻片。

2 方法

2.1 冰凍切片的制作 隨機(jī)選取術(shù)中送檢的新鮮組織三塊并標(biāo)記為A、B、C，A是肺組織，B是肺組織，C是甲狀腺，對(duì)三塊組織取完材，用紗布或?yàn)V紙吸干表面的液體，將要切取的平面朝下放到冰凍托上面，用OCT包埋，在液氮表面停留約30秒，液氮速凍，然后每塊組織切成厚5um的冰凍切片各2張，冰凍切片用TOMO載玻片貼附，貼片時(shí)手要穩(wěn)，片子分別標(biāo)記為A1、A2、B1、B2、C1、C2。

2.2 冰凍切片的處理 切完的6張片子分別采用不同的處理方法：①A1、B1、C1片切完迅速放入4%福爾馬林固定液中，固定2min，然后放入全自動(dòng)冰凍切片染色機(jī)進(jìn)行HE染色，封片；②A2片切完迅速放入4%福爾馬林固定液中，固定2min，然后純水輕柔地沖洗，放入buffer緩沖液中備用；③B2片切完先干燥2min，然后放入4%福爾馬林固定液中固定2min，純水輕柔地沖洗，放入buffer緩沖液中備用；④C2片切完迅速放入4%福爾馬林固定液中，固定2min，然后空氣干燥，完全干燥之后，純水輕柔地沖洗，放入buffer緩沖液中備用。

2.3 快速免疫組化染色

2.3.1 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷 取出切片A2，B2，C2，輕輕擦去多余的buffer緩沖液，然后置于濕盒中，滴加H2O2和甲醇1∶1的混合物室溫放置2min，時(shí)間不能太長(zhǎng)，太長(zhǎng)可能會(huì)引起某些抗原的丟失。

2.3.2 孵育一抗 取出切片A2、B2、C2，放入buffer緩沖液中輕輕洗滌30s，輕輕擦去多余的buffer緩沖液，然后置于濕盒中，滴加一抗CK，蓋上蓋子，放入37℃恒溫烤箱中，計(jì)時(shí)15min。

2.3.3 孵育二抗 取出切片，放入buffer緩沖液中輕輕洗滌30s，輕輕擦去多余的buffer緩沖液，然后置于濕盒中，滴加二抗，蓋上蓋子，放入37℃恒溫烤箱中，計(jì)時(shí)5min。

2.3.4 滴加DAB 取出切片，放入buffer緩沖液中輕輕洗滌30s，輕輕擦去多余的buffer緩沖液，滴加新鮮配制的DAB液，顯微鏡下控制顯色，顯色完畢的切片放入純水中洗滌。

2.3.5 蘇木精復(fù)染，脫水封片 蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，返藍(lán)液返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯脫去乙醇，櫻花全自動(dòng)封片機(jī)封片。

3 結(jié)果

肉眼觀察三塊組織A、B、C的脫片情況，顯微鏡下觀察細(xì)胞的皺縮情況，如附圖1～3。

附圖2 圖5是B塊組織的冰凍切片HE圖片；圖6是B塊組織的冰凍切片免疫組化圖片，兩者組織大小用肉眼進(jìn)行對(duì)比，組織沒有脫片；圖7是B塊組織冰凍切片HE的細(xì)胞圖；圖8是B塊組織冰凍切片免疫組化的細(xì)胞圖，顯微鏡下觀察，細(xì)胞均無(wú)皺縮。

附圖3 圖9是C塊組織的冰凍切片HE圖片；圖10是C塊組織的冰凍切片免疫組化圖片，兩者組織大小用肉眼進(jìn)行對(duì)比，組織沒有脫片；圖11是C塊組織冰凍切片HE的細(xì)胞圖；圖12是C塊組織冰凍切片免疫組化的細(xì)胞圖，顯微鏡下觀察，細(xì)胞均無(wú)皺縮。

從上述圖中的特征分析，在冰凍切片免疫組化的實(shí)驗(yàn)步驟中，切完片直接固定然后進(jìn)行免疫組化染色的，很容易脫片；切完片先干燥2min然后再固定再進(jìn)行免疫組化染色的，不脫片；切完片先固定再空氣完全干燥切片的，不脫片；細(xì)胞都沒有發(fā)生皺縮的情況；筆者又在其他的組織類型中，如陰莖、腎、闌尾等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 討論

快速免疫組化運(yùn)用于術(shù)中冰凍的主要技術(shù)要點(diǎn)有：①冰凍切片固定前干燥2min，能夠保證組織不脫片，為什么選擇2min？筆者也實(shí)驗(yàn)過(guò)干燥1min和3min，1min部分組織會(huì)脫片，3min組織未脫片，但是干燥時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞越容易皺縮，所以最后摸索出來(lái)的時(shí)間是2min；②冰凍切片固定完水洗后空氣完全干燥，組織不脫片，筆者也嘗試過(guò)組織空氣干燥過(guò)程中，等組織半干燥就進(jìn)行后續(xù)的染色，結(jié)果未完全干燥的組織很容易脫片，所以才選擇空氣完全干燥組織；③由于切片固定時(shí)間較短，不至于導(dǎo)致交聯(lián)，所以行快速免疫組化前無(wú)需進(jìn)行抗原修復(fù)，為臨床手術(shù)爭(zhēng)取時(shí)間；④一抗及二抗孵育后的清洗特別關(guān)鍵，充分清洗可減少非特異結(jié)合引起的背景染色，但是清洗時(shí)動(dòng)作要輕柔，防止組織脫片。

常規(guī)的石蠟切片免疫組化技術(shù)已經(jīng)很成熟，但是石蠟切片抗原丟失現(xiàn)象較常見，修復(fù)效果有些不理想，而冰凍切片其組織固定時(shí)間很短，基本無(wú)需微波和高壓等熱修復(fù)，制作過(guò)程與石蠟切片比較更為快捷、簡(jiǎn)便，因此更適合于抗原抗體的免疫組化檢測(cè)[3][4]。術(shù)中冰凍切片結(jié)合快速免疫組化染色可大幅提高術(shù)中冰凍切片病理診斷正確性和效率[5]。