汪鋆植 邊 宇 鄧改改，2 吳 翠 李 澳 廖興悅 黃永梅

(1.三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室/湖北省土家族醫(yī)藥研究所，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

3-羥基根皮苷是湖北海棠茶中主要成分之一[1]，湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.)Rehd.)藥食兩用，已被收錄于《湖北中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[2]中，具有降血糖、抗氧化、保肝護肝、減毒[3]等多種功效.湖北海棠嫩葉經(jīng)過發(fā)酵加工制成的代用茶稱海棠茶.湖北海棠葉中含豐富的黃酮類化合物，其中含量最高的為根皮苷(3.26～52.23 mg/g)，其次是3-羥基根皮苷(4.29～40.29 mg/g).文獻研究表明，根皮苷具有改善胰島素抵抗[4]、胰島素增敏、抑制葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白[5]、增強糖耐量、抑制糖異生[6]等作用，而且根皮苷已廣泛用于降糖藥物的研發(fā)，卡格列凈、達格列凈、恩格列凈等降糖藥物就是以根皮苷為前體合成[7].研究表明湖北海棠具有降糖作用，其作用可能是多成分、多靶點作用的結(jié)果.3-羥基根皮苷具有與根皮苷類似的結(jié)構(gòu)，但少有對3-羥基根皮苷降糖作用的報道，所以本文對3-羥基根皮苷降糖作用進行研究，并觀察其對血糖穩(wěn)態(tài)的影響，為進一步探討海棠茶中不同成分降糖作用的相互關(guān)系，更合理利用海棠茶提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

3-羥基根皮苷(由三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用實驗室提供，純度98%，湖北海棠葉中分離)；肝癌細(xì)胞HepG2(南京科佰生物有限公司)；昆明小鼠(雌雄各半，體重(20±2.0)g)(三峽大學(xué)動物實驗中心提供，spf級昆明小鼠)；DMEM高糖型培養(yǎng)基(高于4 500 mg/L)(美國Gibco公司)；磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffersaline)(solarbio公司)；胰蛋白消化酶(美國Sigma公司)；噻唑藍(MTT)(美國Amresco公司)；血糖測試儀(三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司)；葡萄糖測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解液(radio-immuno precipitationassay)(solarbio公司)；二甲雙胍(美國Sigma公司產(chǎn)品).

1.2 方法

1.2.1 胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞的建立

參考許樂等[8]方法建立胰島素抵抗模型，復(fù)蘇HepG2細(xì)胞，二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng).待細(xì)胞完全貼壁并長滿培養(yǎng)瓶80%以上，生長狀態(tài)良好時，進行細(xì)胞傳代，在DMEM培養(yǎng)基中加入10-6mol·L-1胰島素，作用時間48 h，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗.

1.2.2 3-羥基根皮苷對胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞存活率的影響

取對數(shù)生長期的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞以5×104個/mL的密度接種于96孔板，100 μL/孔，貼壁生長12 h后，加入100 μL/孔不同濃度3-羥基根皮苷，終質(zhì)量濃度分別為120、100、80、60、40 μg/mL，每個質(zhì)量濃度設(shè)定3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h后，MTT法檢測細(xì)胞的存活率，根據(jù)[OD(對照組)/OD(給藥組)]×100%=相對存活率，計算相對存活率.

1.2.3 3-羥基根皮苷對胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞攝入葡萄糖的影響

取對數(shù)生長期的胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞，以3×104個/mL密度接種于24孔板，200 μL/孔，貼壁生長12 h后，加入終質(zhì)量濃度分別為120、100、80、60、40 μg/mL的3-羥基根皮苷，分別培養(yǎng)24 h、48 h后，培養(yǎng)基中的葡萄糖經(jīng)葡萄氧化酶作用，生成葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下，將還原性4-氨基安替比林與酚偶聯(lián)縮合成可測定的醌類化合物.通過測定OD值，根據(jù)[OD值(樣品)/OD值(校準(zhǔn)品)×5.5 mmol/L(校準(zhǔn)液濃度)]/相對存活率=相對葡萄糖量(mmol/L)，計算相對葡萄糖量.

1.2.4 二型糖尿病小鼠模型建立

昆明小鼠48只，分成6組，每組各8只，以高糖高脂飲食聯(lián)合低劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ).STZ組織毒性較小、造模穩(wěn)定、種屬選擇性不強.為降低模型死亡率，提高模型成模率，對小鼠進行少量多次STZ注射[9].檸檬酸鹽緩沖液的配制：稱量2.1 g檸檬酸(分析純)，用超純水定容至100 mL配制成A液；稱量2.94 g檸檬酸二鈉(分析純)，用超純水定容至100 mL配制成B液；按A∶B=1∶1(體積比)的比例混合，調(diào)整pH值至4.2～4.5之間，4℃保存?zhèn)溆?STZ易分解，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配.

高脂高糖飼養(yǎng)4周后，STZ腹腔注射進行造模.誘導(dǎo)小鼠發(fā)生胰島素抵抗.第5周，禁食12 h后，將STZ按照40 mg/kg的劑量溶于0.1 mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.2)中，對小鼠下腹部進行注射，分上下午注射兩次，2 d后，觀察飲食量、飲水量及血糖值，對血糖不達標(biāo)的小鼠進行補充注射.

1.2.5 3-羥基根皮苷對小鼠糖耐量的影響

糖尿病小鼠48只，雌雄各半，分為空白組、模型組、陽性組、3-羥基根皮苷低中高劑量組及根皮苷低中高劑量組.正常昆明小鼠40只，雌雄各半，分為空白組、陽性對照組、3-羥基根皮苷低中高劑量組及根皮苷低中高劑量組.根據(jù)湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，湖北海棠適用量2～5 g，湖北海棠中根皮苷含量約8.72%，根據(jù)體重及人與小鼠換算系數(shù)計算得到根皮苷劑量范圍約30～80 mg/kg.3-羥基根皮苷劑量參考根皮苷分別為40、60和80 mg/kg.

隔夜禁食12 h，灌胃給藥，空白組、模型組給予相等體積的雙蒸水，陽性對照組給予二甲雙胍(10 mg/kg)，測定血糖濃度，記做0 h血糖濃度，之后各組均給予葡萄糖溶液3 g/kg，每只小鼠0.4 mL，灌胃葡萄糖溶液30、60、120 min后尾靜脈取血測各組的血糖，測定各組糖耐量.

1.2.6 3-羥基根皮苷對小鼠空腹、餐后血糖的影響

糖尿病小鼠及正常小鼠分組及灌胃劑量同上.空腹血糖測定：正常飼料喂養(yǎng)，灌胃給藥后，禁食2 h、4 h，分別測定血糖含量.餐后血糖測定：禁食12 h，灌胃給藥，再給予飼料喂養(yǎng)2 h，對餐后血糖進行測定.

1.2.7 3-羥基根皮苷對小鼠肝臟內(nèi)G-6-Pase表達的影響

分別對空腹血糖、餐后血糖實驗中的小鼠進行斷脊椎處死，取肝組織，將肝組織用生理鹽水洗凈后，加入蛋白裂解液，在冰盒上充分研磨，待充分裂解后，通過BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度；進行SDS-PAGE凝膠電泳，條帶經(jīng)TBST洗3次后，5%脫脂奶粉于TBST溶液中溶解，進行封閉，封閉2 h后，洗條帶3次，放入稀釋好的一抗液，充分浸泡濾膜，室溫孵育1 h后，4℃冰箱孵育過夜.用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，用二抗稀釋液充分浸泡濾膜，室溫孵育1 h.將濾膜與顯影試劑盒的試劑作用，進行顯影.觀察3-羥基根皮苷對小鼠空腹及餐后狀態(tài)下G-6-Pase表達的影響.

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞的建立

由表1可知，在胰島素濃度為10-6mol/L，作用48 h時，HepG2細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且出現(xiàn)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài).

表1 不同濃度胰島素作用24 h/48 h對HepG2細(xì)胞存活率及葡萄糖代謝的影響

2.2 3-羥基根皮苷對胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞存活率的影響

由表2可知，24 h、48 h時，3-羥基根皮苷濃度100 μg/mL與模型組相比，差異無顯著性(P>0.05).所以，3-羥基根皮苷濃度小于等于100 μg/mL時，對胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞存活率沒有影響，因此，3-羥基根皮苷實驗濃度定為小于等于100 μg/mL.

表2 3-羥基根皮苷作用24 h/48 h對胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞存活率的影響

2.3 3-羥基根皮苷對胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞對葡萄糖攝取的影響

由表3可知，作用24 h、48 h時，3-羥基根皮苷各濃度與模型組相比，差異均具有顯著性(P<0.05)，表明3--羥基根皮苷可改善胰島素抵抗模型細(xì)胞HepG2的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，促進對外周葡萄糖的吸收.

表3 3-羥基根皮苷作用24 h/48 h對胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

2.4 二型糖尿病小鼠模型建立

模型組體重與空白組相比，差異具有顯著性，同時對飲食和飲水量等觀察，也出現(xiàn)多飲多食多尿的癥狀，符合二型糖尿病“三多一少”癥狀.通過對模型組空腹血糖測定，模型組空腹血糖值約為空白組2倍.說明二型糖尿病小鼠模型建立成功.

2.5 3-羥基根皮苷對小鼠糖耐量的影響

由表4可知，正常小鼠攝入葡萄糖后引起血糖升高，但2 h內(nèi)血糖會恢復(fù)至空腹水平.給予葡萄糖0.5 h后各組血糖與0時血糖相比較均顯著升高，但各給藥組與空白組相比，血糖升高程度降低，差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)；給予葡萄糖1 h后，各組血糖開始降低，3-羥基根皮苷中、高劑量組與空白組相比，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)；給予葡萄糖2 h后，各組血糖繼續(xù)降低，除陽性組與3-羥基根皮苷高劑量組外，各組與空白組相比，差異無顯著性.由表5可知，糖尿病小鼠攝入葡萄糖后引起血糖升高，由于胰島功能受損，糖耐受力受損，2 h血糖不能回復(fù)至空腹水平.小鼠給予葡萄糖0.5 h后各組血糖與0時血糖相比較均顯著升高，但各組與模型組相比，血糖升高程度降低，差異有顯著性(P<0.01)；給予葡萄糖1 h后，各組血糖開始降低，除3-羥基根皮苷低劑量組與模型組相比差異無顯著性，其它組差異均具有顯著性(P<0.01)；給予葡萄糖2 h后，各組血糖繼續(xù)降低，除3-羥基根皮苷低劑量組外，各組與模型組相比，差異有顯著性(P<0.05，P<0.01).糖耐量實驗表明3-羥基根皮苷可增強正常小鼠和糖尿病小鼠的糖耐受力.

表4 3-羥基根皮苷對正常小鼠糖耐量的影響

表5 3-羥基根皮苷對糖尿病小鼠糖耐量的影響

2.6 3-羥基根皮苷對小鼠空腹血糖的影響

由表6可知，與空白組相比，禁食2 h后，除3-羥基根皮苷低劑量組外，其它各組與空白組相比，血糖升高，差異具有顯著性(P<0.01)；禁食4 h后，各劑量組血糖升高，3-羥基根皮苷高劑量組血糖與空白組相比，差異具有顯著性(P<0.01)，其它各組與空白組相比，差異無顯著性.與空白組相比，餐后2 h后，3-羥基根皮苷高劑量和陽性藥組與空白組相比，血糖明顯降低，差異具有顯著性(P<0.01)，其它各組與空白組相比，血糖值有降低，但差異無顯著性.表明3-羥基根皮苷對正常小鼠具有升高空腹血糖，降低餐后血糖的作用，高劑量作用顯著.

表6 3-羥基根皮苷對正常小鼠空腹及餐后血糖的影響 (單位：mmol/L)

由表7可知，與空白組相比，禁食2 h后，各組與模型組相比，差異具有顯著性(P<0.01)；禁食4 h后，各劑量組血糖逐漸降低，模型組與其它組相比，差異仍具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，給藥組血糖已逐漸接近空白組血糖.與空白組相比，餐后2 h后，3-羥基根皮苷高劑量和陽性藥組與模型組相比，血糖明顯降低，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01).表明3-羥基根皮苷各劑量均能降低糖尿病小鼠空腹血糖和餐后血糖，且高劑量作用顯著.

表7 3-羥基根皮苷對糖尿病小鼠空腹及餐后血糖的影響 (單位：mmol/L)

2.7 3-羥基根皮苷對小鼠肝臟中G-6-Pase表達的影響

2.7.1 3-羥基根皮苷對空腹小鼠肝臟中G-6-Pase表達的影響

由圖1可知，在正常小鼠空腹?fàn)顟B(tài)下，血糖水平相對較低時，3-羥基根皮苷各劑量組與空白組相比，增加G-6-Pase的表達，差異具有顯著性(P<0.01).由圖2可知，在糖尿病小鼠空腹?fàn)顟B(tài)下，血糖水平仍高于正常水平，3-羥基根皮苷中、高劑量組與模型組相比均抑制G-6-Pase的表達，差異具有顯著性(P<0.01).結(jié)果表明，3-羥基根皮苷對不同血糖值下，對G-6-Pase存在雙向調(diào)節(jié)的作用.

圖1 3-羥基根皮苷對正常小鼠空腹時肝臟中G-6-Pase表達的影響

圖2 3-羥基根皮苷對糖尿病空腹時肝臟中G-6-Pase表達的影響

2.7.2 3-羥基根皮苷對餐后小鼠肝臟中G-6-Pase表達的影響

由圖3和圖4可知，正常小鼠及糖尿病小鼠餐后狀態(tài)下，血糖水平較高，3-羥基根皮苷各劑量組均抑制G-6-Pase的表達，差異具有顯著性(P<0.01).結(jié)果表明，3-羥基根皮苷可以降低餐后狀態(tài)下G-6-Pase的表達.圖4中，糖尿病小鼠低劑量時G-6-Pase表達量低于中劑量，可能與高血糖水平有關(guān).

圖3 3-羥基根皮苷對正常小鼠餐后肝臟中G-6-Pase表達的影響

圖4 3-羥基根皮苷對糖尿病小鼠餐后肝臟中G-6-Pase表達的影響

3 討 論

通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，3-羥基根皮苷可以改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，增加對葡萄糖攝取，降低血糖，調(diào)節(jié)糖異生關(guān)鍵酶G-6-Pase，穩(wěn)定血糖，對糖尿病防治具有積極作用.

血糖波動帶來的危害比血糖絕對值偏高更大[10]，研究發(fā)現(xiàn)3-羥基根皮苷不僅具有降低血糖的作用，還可以穩(wěn)定血糖，減少血糖波動.因此，3-羥基根皮苷具有良好的研究利用潛力.餐后、餐前血糖通常是一天血糖中的高峰低谷，尤其對于糖尿病前期或糖尿病患者，胰島素分泌不足和胰島素抵抗，不能有效促進組織細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用，使得體內(nèi)糖脂代謝紊亂[11].本實驗中，分別對正常小鼠和糖尿病小鼠的空腹血糖及餐后血糖進行測定，結(jié)果表明，3-羥基根皮苷對小鼠餐后血糖升高均具有降低的作用，但對不同健康狀況小鼠的空腹血糖調(diào)控，出現(xiàn)了不同結(jié)果，糖尿病小鼠的空腹血糖值高于正常水平，3-羥基根皮苷降低其血糖水平，正常小鼠的空腹血糖值低，3-羥基根皮苷升高其血糖水平，具有穩(wěn)定血糖的作用.其作用與雙向調(diào)控糖異生關(guān)鍵酶G-6-Pase有關(guān).G-6-Pase是糖異生過程中關(guān)鍵酶，決定糖異生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，肝糖原經(jīng)糖原磷酸化酶催化降解為葡萄糖-1-磷酸(glucose-1-P)，再經(jīng)變位酶作用生成葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-P)，最后在葡萄糖-6-磷酸酶的作用下脫去磷酸而輸出葡萄糖，一定程度上維持血糖平衡[12].3-羥基根皮苷對正常小鼠及糖尿病小鼠餐后G-6-Pase表達具有抑制作用；對糖尿病小鼠空腹高血糖時，抑制G-6-Pase的表達，而對正常小鼠空腹低血糖時增強G-6-Pase的表達，與血糖測定結(jié)果趨勢一致.綜上所述，3-羥基根皮苷不僅具有降低血糖的作用，還可以起到穩(wěn)定血糖、減少血糖波動的作用，其機制與3-羥基根皮苷可以雙向調(diào)節(jié)糖異生關(guān)鍵酶G-6-Pase表達有關(guān).

海棠茶是土家族飲茶，也是湖北、湖南、重慶等地習(xí)用的餐飲茶，習(xí)稱化紅茶，具有悠久的飲用歷史.海棠茶中根皮苷[13]及3-羥基根皮苷等成分共同作用，既有助于降低糖尿病人血糖，又有助于穩(wěn)定正常和糖尿病人血糖，避免低血糖的發(fā)生，還可延緩胰島素功能受損.同時海棠茶還可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，是品質(zhì)優(yōu)秀的餐飲茶，值得進一步推廣利用.