李維蛟，任 可，浦仕彪

（1云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明650500；2西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶400715）

0 引言

栽培三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]亦稱“田三七”、“山漆”、“田漆”，為五加科人參屬多年生草本植物。它始載于《本草綱目》，被譽為血癥良藥、傷科要藥。栽培三七已被國家列為貴重藥材，《中國醫(yī)藥大辭典》[1]和《中華人民共和國藥典》[2]等文獻書籍中都對栽培三七作了充分的肯定性的記載，有“金不換”、“南國神草”等美譽[3]。栽培三七為云南道地藥材[4]。對于栽培三七內(nèi)生真菌的研究比較豐富的主要是文三地區(qū)，許多研究工作者對栽培三七內(nèi)生真菌進行了分離并通過18S-ITS-28S rDNA序列分析進行鑒定。結(jié)果從根、莖、葉組織中分離得到158株形態(tài)各異的內(nèi)生真菌。對其中92株的ITS序列分析顯示，91株分屬于19個已知屬，另1株真菌的ITS序列與GenBank中已報道的序列最高相似性為82%，認為是一新種，得出栽培三七內(nèi)生菌多樣性豐富，同時不同部位內(nèi)生菌的數(shù)量、種類及分布存在差異[5]，還有科研工作者開展了從栽培三七內(nèi)生真菌對病原菌的抑制作用或者其生物活性研究[6-7]。

近年來對于栽培三七的需求量不斷增加，其種植面積不斷擴大。但是由于栽培三七受到嚴(yán)重的連作障礙影響，而導(dǎo)致栽培三七連作障礙的一個主要原因就是病害。其中以根腐病最為突出，這是一種嚴(yán)重的土傳病害，栽培三七因根腐病害的常年損失達5%～20%，嚴(yán)重的達70%，所造成的損失占各種栽培三七病害的70%～85%，成為制約栽培三七產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境建設(shè)的重要屏障，而導(dǎo)致栽培三七根腐病的主要病原真菌是毀壞柱孢霉(Cylindrocarpon destructans)[8]和三七根腐病尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)[9-11]。

云南是目前公認的栽培三七道地藥材的主產(chǎn)區(qū)，占栽培三七年產(chǎn)量的95%。近些年研究發(fā)現(xiàn)，從藥用植物中分離出的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生和宿主植株相同或者相似的生物活性物質(zhì)。通過分離和篩選得到活性內(nèi)生真菌，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后非常方便的獲得大量的活性生物成分，這為解決傳統(tǒng)中藥材短缺的現(xiàn)狀提供了一種非常理想的方案，為內(nèi)生真菌資源的開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。本實驗對栽培三七各組織的內(nèi)生真菌進行了分離、鑒定和多樣性分析，為栽培三七內(nèi)生真菌資源開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

栽培三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)根、莖、葉采于云南省曲靖市師宗縣，植株年齡為三年。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離 將剛移栽的新鮮栽培三七的須根、主根、莖、葉分別剪下，用自來水沖洗干凈泥土。將其轉(zhuǎn)移至已經(jīng)紫外燈消毒15 min的超凈工作臺中（ZHJH-C1209B超凈工作臺，上海智城分析儀器有限公司）。用75%乙醇對雙手進行消毒處理。分別對不同組織進行消毒。75%乙醇浸泡須根30 s，主根50 s，莖40 s，葉30 s。0.1%升汞浸泡須根4 min，主根15 min，莖5 min，葉3 min。分別用無菌水沖洗3次，備用。將浸泡過無水乙醇的鑷子和手術(shù)剪置于酒精燈上灼燒，冷卻備用。取出高溫滅菌過的空培養(yǎng)皿置于酒精燈外焰范圍內(nèi)，用冷卻的鑷子分別夾取須根、主根、莖、葉，使其全面與凝固的培養(yǎng)基接觸后取出，以完成空白對照。用手術(shù)剪將須根、主根、莖、葉剪成0.5 cm×0.5 cm左右的小塊。分別接種于培養(yǎng)基上，每一部位接種20皿。用記號筆標(biāo)號記號，用保鮮袋包好后放置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。待材料周圍長出菌絲后，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺上。雙手消毒，點燃酒精燈，將解剖針置于火焰上灼燒至通紅，挖取菌落邊緣帶有少量菌絲的瓊脂塊，迅速轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基上，做好標(biāo)記，繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 內(nèi)生真菌的保存 內(nèi)生真菌采用石蠟油和濾紙片2種方法保存。將石蠟油于121℃下保溫2 h，菌株在斜面試管中培養(yǎng)一段時間后，上面倒入一層石蠟油，加入石蠟油的量應(yīng)超過斜面頂部1 cm，于4℃下保存。濾紙片法保存的步驟為：先用打孔器把濾紙打成小圓片，滅菌，放入培養(yǎng)皿中，同時在培養(yǎng)皿中接種真菌，等菌絲長滿之后取出含有菌絲的濾紙片，放入無菌的錫箔紙中，于-20℃下保存。

1.2.3 內(nèi)生真菌的形態(tài)觀察 參照戴芳瀾《中國真菌總匯》所述對所分離到的真菌進行鑒定[12]。將分離到的代表性內(nèi)生真菌進行形態(tài)觀察，主要觀察菌落在平板上的生長速度、菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中。在顯微鏡下觀察菌絲的粗細，分生孢子器的著生部位、形狀、類型、大小、產(chǎn)孢方式，以及分生孢子的出芽方式、是否有隔、大小、形狀、表面特征、色澤等形態(tài)特征。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 采用CTBA法提取真菌基因組DNA。ITS擴增使用的引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3')，兩者為通用引物，由昆明擎科生物有限公司合成。50 μL PCR反應(yīng)體系為：10 μL 10×PCR Buffer，0.25 μL dNTPs(10 mmol/L)，1 μL ITS4，1 μL ITS5，0.3 μL Taq酶，1 μL DNA模板，用ddH2O補足 50 μL。擴增程序：94℃ 4 min，94℃ 1 min，54℃1 min，72℃ 1 min，33個循環(huán)，72℃ 3 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物由昆明擎科生物有限公司測序。測序結(jié)果通過Chromas軟件校對，以每個形態(tài)型菌株的ITS序列作為靶序列，在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中通過Blast搜索，將相似度最高的序列作為參考序列，并用于系統(tǒng)發(fā)育分析和鑒定。確定序列的有效性；打開序列文件并復(fù)制該序列；打開NCBI網(wǎng)站，進入BLAST功能區(qū)域選擇Nucleotide BLAST；粘貼序列于序列框，輸入序列編號，勾選“show results in a window”；點擊BLAST；根據(jù)ident（百分比）確定所測樣品序列的分類地位。RensKe Landeweer等[13]認為通過ITS區(qū)域比對，序列相似性大于99%，鑒別為相同種；序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為相同屬，序列相似性小于95%，鑒別為相同科。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離

從栽培三七不同部位中分離出的內(nèi)生真菌種類有差異，并且分布頻率不盡相同。從葉片上分離出內(nèi)生真菌11株，占總共分離出內(nèi)生真菌的45.83%，其中以3號和6號菌種為優(yōu)勢菌，均葉片分離菌種的27.28%；莖部分離出內(nèi)生真菌1株，占總共分離出內(nèi)生真菌的4.17%；主根分離出內(nèi)生真菌1株，占總共分離出內(nèi)生真菌的4.17%；須根分離出內(nèi)生真菌11株，占總共分離出內(nèi)生真菌的45.83%，其中以9號菌種為優(yōu)勢菌種，占須根分離菌種的72.73%。由此可見，栽培三七的葉、莖、主根和須根內(nèi)生真菌在數(shù)量、種群分布和優(yōu)勢種群方面有差異，這表明栽培三七內(nèi)生真菌數(shù)量和種群的多樣性特點。

2.2 內(nèi)生真菌的形態(tài)鑒定及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

根據(jù)菌落生長速率、形態(tài)、顏色，以及菌絲、產(chǎn)孢器、孢子梗、分生孢子等顯微形態(tài)特征，將內(nèi)生真菌劃分為12類，每1類中選取1株具有代表性的菌株進行觀察，共12株，編號分別為1～12，代號分別為A～J。

對分離出的24株內(nèi)生真菌進行了DNA提取和PCR擴增，根據(jù)ITS序列與GenBank中的序列同源性關(guān)系，將所得菌種歸類為12個屬（種）（表2）。從種屬歸類可見栽培三七內(nèi)生真菌種類多樣性豐富。其中葉片中的優(yōu)勢菌種為3號普通青霉菌(Penicillium commune)和6號菌膠孢刺盤孢菌(Colletotrichum gloeosporioides)，須根中的優(yōu)勢菌為9號球毛殼菌(Chaetomidiumarxii)均是分離株數(shù)較高，數(shù)量較大的優(yōu)勢菌種。至于莖中只分離出來7號球殼菌(Chaetomiumfunicola)，主根中分離出來8號菌孢鐮孢菌(Fusarium redolens)。說明內(nèi)生菌普遍存在于栽培三七的葉和根中。

表1 栽培三七不同部位內(nèi)生真菌的數(shù)量與種類分布

表2 栽培三七內(nèi)生真菌種類及菌落形態(tài)特征

對葉片中分離出的優(yōu)勢菌3號和6號進行鑒定：其中3號菌菌落生長緩慢，質(zhì)地細膩，邊緣呈淡褐綠色。正面顏色為深褐綠色，背面顏色為黃綠色，中央有灰色凸起（圖1-C、圖1-F）。將該真菌的ITS全序列（圖2）提交到GenBank核酸序列庫中進行比對。結(jié)合形態(tài)和分子鑒定結(jié)果初步確定3號菌株為普通青霉菌(Penicilliumcommune)。

圖1 內(nèi)生真菌PDA培養(yǎng)菌落生長圖

圖2 三號菌株ITS全序列

其中6號菌菌落生長迅速，質(zhì)地細膩，菌落正反面均呈現(xiàn)乳白色，菌絲密集。將該真菌的ITS全序列（圖3）提交到GenBank核酸序列庫中進行比對。結(jié)合形態(tài)和分子鑒定結(jié)果初步確定6號菌株為膠孢刺盤孢菌(Colletotrichumgloeosporioides)。

圖3 六號菌株ITS全序列

對須根中分離出的優(yōu)勢菌9號進行鑒定：9號菌的菌落形態(tài)特征如圖1-I所示。其中9號菌菌落生長迅速，菌絲呈墨綠色，周圍多分布黑色球狀菌核，菌落邊緣呈淡黃綠色。正面顏色為墨綠色，背面顏色為黃綠色。將該真菌的ITS全序列（圖4）提交到GenBank核酸序列庫中進行比對。結(jié)合形態(tài)和分子鑒定結(jié)果初步確定9號菌株為球毛殼菌(Chaetomidiumarxii)。

圖4 九號菌株ITS全序列

3 討論

本實驗是對栽培三七內(nèi)生真菌進行了分離、鑒定。由于分離栽培三七的各部位數(shù)量、分離手段的限制，推測該植物中還有許多內(nèi)生真菌尚未被分離出來。通過實驗結(jié)合前人的研究成果，初步推斷出植物內(nèi)生真菌幾乎存在于所有的植物中，且絕大多數(shù)內(nèi)生真菌還沒有被研究，因此深入挖掘植物內(nèi)生真菌中生物活性物質(zhì)，在農(nóng)藥、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景[14-17]。

栽培三七內(nèi)生真菌種類較多，可以對其進行進一步研究，可以開發(fā)其潛在的價值。對于栽培三七內(nèi)生菌和其病原菌的研究已有結(jié)果表明從栽培三七內(nèi)生真菌中可以篩選出對栽培三七根腐病主要原真茵具有良好抑制作用的菌種。所以重點可以放在對栽培三七病害的控制方面，比如根腐病的主要病原真菌是毀壞柱孢菌和栽培三七尖孢鐮刀菌，可以對栽培三七內(nèi)生真菌進行分離，然后進行抑菌性實驗，篩選出具有對該病菌有強烈抑制性的內(nèi)生真菌[17-18]。

此外，栽培三七內(nèi)生真菌中有些常見菌種，可以作為生防菌種，值得研究開發(fā)防治植物病害方面。有文獻顯示，毛殼菌屬真菌不僅在栽培三七中出現(xiàn)，而且廣布于自然界[19-20]，是一種可以用于防治多種作物、林木的真菌。還有些能產(chǎn)生紫杉醇例如多節(jié)孢屬的真菌[21]，這種萜類生物堿對抑制腫瘤細胞具有非常好的活性。眾所周知，紫杉醇從1963年被發(fā)現(xiàn)到用于臨床研究抗腫瘤活性以來[22]，其來源植物紅豆杉種群不斷受到嚴(yán)重破壞，這樣的發(fā)現(xiàn)無異于是找到了另一種途徑得到紫杉醇，非常值得研究。

在進行分離實驗的過程中發(fā)現(xiàn)，由于操作不當(dāng)會引入細菌和真菌，當(dāng)這些外來的菌種著生在已經(jīng)長有內(nèi)生真菌的培養(yǎng)基上時，這些外來菌很多都會被抑制，這一發(fā)現(xiàn)可為將來開發(fā)研究栽培三七內(nèi)生真菌抗菌活性成分提供依據(jù)。還有些內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生綠色能源[23]，這是一種非常環(huán)保的能源動力，在這個倡導(dǎo)低碳節(jié)能的社會，這種能源將會是研究的熱點。所以，從栽培三七內(nèi)部可以找到許多值得開發(fā)研究的內(nèi)生真菌，尤其是研究其病害控制方面，值得進一步研究。

4 結(jié)論

（1）依據(jù)《中國真菌總匯》所述對所分離到的真菌進行形態(tài)學(xué)描述和鑒定，對24株真菌獲得的序列與已有NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列比對分析，得到炭角菌屬(Xylariaceaesp.)1株、鏈格孢菌(Alternariaalternate)2株、普通青霉菌(Penicilliumcommune)3株、擔(dān)子菌(Bjerkanderaadusta)2株、柄孢殼屬(Podosporasp.)1株、膠孢刺盤孢菌(Colletotrichumgloeosporioides)3株、繩生毛殼菌(Chaetomiumfunicola)1株、芳香鐮孢菌(Fusariumredolens)1株、球毛殼菌(Chaetomidium arxii)8株、梭孢殼屬(Thielaviasp.)1株及金黃毛殼菌(Chaetomiumaureum)1株。

（2）對栽培三七寄生真菌分離所得的菌落分析所知，普通青霉菌(P.commune)、膠孢刺盤孢菌(C.gloeosporioides)及球毛殼菌(C.arxii)為優(yōu)勢種群。