楊 豆，石福習(xí)，萬松澤，李廣強(qiáng)，孔令剛，張 揚(yáng)＊

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，國家林業(yè)和草原局鄱陽湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2. 山東省棗莊農(nóng)業(yè)農(nóng)村事業(yè)發(fā)展中心，山東 棗莊 277000；3. 濟(jì)南市林業(yè)科技推廣站，山東 濟(jì)南 271100)

磷（P）是植物生長和發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，在植物細(xì)胞分裂、生物合成等生理過程扮演著重要角色。研究顯示，增加土壤磷有效性對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的提升具有顯著影響[1-5]，而采用NaHCO3、酸性氟化銨（NH4F）等單一提取劑評(píng)估土壤磷有效性的方法無法完全反映土壤中不同形態(tài)磷間的復(fù)雜轉(zhuǎn)化關(guān)系[6]。恰當(dāng)?shù)耐寥懒追旨?jí)方法能較好地理解土壤磷素的轉(zhuǎn)化過程，Chang等[7]將土壤無機(jī)磷分為鈣結(jié)合態(tài)磷（Ca-P）、鋁結(jié)合態(tài)磷（Al-P）、鐵結(jié)合態(tài)磷（Fe-P）和閉蓄態(tài)磷（Occluded-P）4個(gè)組分，適用于石灰土壤；Hedley等[8]將土壤磷分為樹脂交換態(tài)磷、土壤微生物磷、NaOH溶性磷和殘留磷等7個(gè)組分，兼顧了土壤無機(jī)磷和有機(jī)磷，適用于酸性土壤[9-10]。這些方法雖能評(píng)估土壤磷有效性程度，卻無法充分反應(yīng)根際過程帶來的貢獻(xiàn)，如有機(jī)酸、質(zhì)子和胞外酶的分泌降解作用[11]。DeLuca等[12]從生物學(xué)利用的難易程度研發(fā)出評(píng)價(jià)生物有效性磷的分級(jí)方法（BBP法），該方法主要依據(jù)植物和微生物分泌有機(jī)酸、酸性磷酸酶等機(jī)制進(jìn)行分類，將土壤磷素分為：（1）CaCl2提取的可溶性磷（CaCl2-P），直接可被根際截留或擴(kuò)散的磷酸根離子；（2）檸檬酸提取的磷（Citrate-P），可被有機(jī)酸活化釋放的無機(jī)磷；（3）酶提取的磷（Enzyme-P），被植物和微生物分泌的磷酸酶和植酸酶礦化的有機(jī)磷；（4）鹽酸提取的無機(jī)磷（HCl-P），可被H+活化的最大潛力磷庫。

毛竹（Phyllostachys edulis(Carrière) J. Houz.）是一種典型的克隆植物，主要分布于我國南方丘陵紅壤地區(qū)，具有生長速度快、木材質(zhì)量優(yōu)、觀賞價(jià)值高等特點(diǎn)，是我國南方重要的經(jīng)濟(jì)樹種[13]。近年來，隨著毛竹人工林面積擴(kuò)大及間伐期縮減，竹林資源質(zhì)量下降，地力衰退，已嚴(yán)重影響了竹林的經(jīng)營發(fā)展。研究顯示，磷已成為毛竹林生產(chǎn)力提高的主要限制因子之一[14]，而過度施用化學(xué)磷肥導(dǎo)致竹林土壤形成儲(chǔ)量可觀的潛在磷庫，故如何活化竹林土壤潛在磷庫，緩解竹林土壤有效磷短缺是竹林可持續(xù)經(jīng)營發(fā)展亟需解決的問題。解磷微生物作為土壤有益微生物種類之一，可通過釋放有機(jī)酸、質(zhì)子等方式將土壤潛在磷庫中的難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶性磷，促進(jìn)植物生長。以往部分研究表明，添加生物有機(jī)肥可提高土壤相關(guān)酶活性，從而提升土壤有效養(yǎng)分[15]，而解磷微生物在調(diào)控土壤磷有效性含量中是否存在土壤酶活性介導(dǎo)作用仍有待證實(shí)，且關(guān)于解磷微生物對(duì)毛竹林土壤磷組分有何影響還尚未明確，解磷微生物如何調(diào)控土壤不同磷組分進(jìn)而影響毛竹生長的報(bào)道甚少。

課題組前期從毛竹根際土壤中獲得1株高效解磷真菌金黃藍(lán)狀菌（Talaromyces aurantiacus(J.H.Mill., Giddens & A.A.Foster)）JXBR04，具有較好的解無機(jī)磷和有機(jī)磷能力[16]。本實(shí)驗(yàn)基于生物有效性的磷分級(jí)方法，通過溫室盆栽試驗(yàn)開展該菌株對(duì)毛竹根際土壤不同磷組分含量的影響及促生作用，明確該菌株對(duì)毛竹根際土壤磷有效性的調(diào)控作用，有望闡明解磷真菌提升竹林土壤有效磷的生物途徑及對(duì)相關(guān)促生機(jī)理做出詮釋。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

金黃藍(lán)狀菌JXBR04分離自毛竹根際土壤，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株保藏號(hào)CCTCC M 2017327。

1.2 菌劑制備及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將菌株JXBR04活化產(chǎn)孢，用0.85%無菌生理鹽水調(diào)節(jié)孢子懸浮液（107cfu·mL-1）制備成液體菌劑。培養(yǎng)基質(zhì)為取自毛竹林地的紅壤，121℃下滅菌2 h后備用。選擇苗齡90 d、生長一致的毛竹實(shí)生苗為試驗(yàn)材料（苗高16.23 cm，地徑0.84 cm），于當(dāng)年3月移植至內(nèi)徑18 cm高18 cm裝有滅菌土壤的花盆中。采用灌根法將20 mL菌劑施入毛竹根際土壤，對(duì)照為施入等量無菌生理鹽水，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，各小區(qū)處理5株，重復(fù)4次，累計(jì)各處理20株，置于溫室大棚內(nèi)，定期澆水管理。

1.3 毛竹凈光合速率和生物量的測定

在毛竹苗培育180 d后選擇晴天上午10：00采用LI-6400光合儀測定毛竹葉片凈光合速率，然后將毛竹苗從土壤中輕輕取出，隨后將各處理竹苗用自來水沖洗干凈。將毛竹苗于105℃下殺青30 min，75℃烘干48 h至恒質(zhì)量，測定毛竹干質(zhì)量，即為毛竹生物量。

1.4 土壤養(yǎng)分及酶活性測定

采用抖落法收集各處理根際土壤，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室放置于4℃冰箱備用。全磷含量采用硫酸-高氯酸消解-鉬銻抗比色法測定；全氮含量采用元素分析儀測定；有機(jī)質(zhì)含量采用硫酸-重鉻酸鉀氧化法測定；銨態(tài)氮含量采用靛酚藍(lán)比色法測定；硝態(tài)氮含量采用氯化鉀浸提-紫外分光光度計(jì)法測定；礦質(zhì)氮含量為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量之和；土壤pH采用電位法pH計(jì)測定；有效磷采用氟化銨-鹽酸浸提法測定[17]。土壤脲酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶活性分別采用靛酚藍(lán)比色法、磷酸苯二鈉比色法、磷酸對(duì)硝基苯酯法[18]及高錳酸鉀滴定法測定[19]。

1.5 土壤磷組分測定

4種萃取劑的配置：取1.11 g無水CaCl2、2.1 g無水檸檬酸、100 μL磷酸酶、85.9 mL鹽酸分別溶于純水中，分別定容至1 L，配置成濃度為0.01 mol·L-1的CaCl2、0.01 mol·L-1的 檸 檬 酸、0.02 Eu·mL-1的酶液和1 mol·L-1的HCl溶液[12]。各處理土樣分別取4份，每份0.5 g置于4個(gè)15 mL離心管中。4種萃取劑各取10 mL平行加入離心管內(nèi)，封口后置于恒溫?fù)u床，于180 rpm、25℃下震蕩3 h。取出震蕩搖勻后的離心管，在2/3處用1 mL槍頭吸取混合液1 mL于1.5 mL離心管離心1 min（10 000 rpm，25℃），采用孔雀石綠法對(duì)上清液中的磷含量進(jìn)行測定[20]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

文中數(shù)據(jù)運(yùn)用Microsoft Excel 2020進(jìn)行整理、SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.5進(jìn)行繪圖。采用配對(duì)t檢驗(yàn)（p＜ 0.05）對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)、磷組分、土壤酶活性和植株生物量進(jìn)行分析，土壤磷組分與土壤化學(xué)性質(zhì)及生物量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析（p＜ 0.05）。圖表中的數(shù)據(jù)均為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株JXBR04制劑對(duì)毛竹凈光合速率及生物量的影響

表1表明：施用解磷菌株JXBR04制劑能顯著提高毛竹葉片生物量和凈光合速率，增幅分別為51.74%[16]、51.74%。

表1 施用菌株JXBR04制劑對(duì)毛竹生長量和凈光合速率的影響Table 1 Effect of added strain JXBR04 on biomass and net photosynthetic rate of moso bamboo seedlings.

2.2 菌株JXBR04制劑對(duì)毛竹土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

表2表明：施用菌株JXBR04制劑180 d后改變了毛竹根際土壤的化學(xué)性質(zhì)，其中，顯著提高了土壤中礦質(zhì)氮、有效磷和有機(jī)質(zhì)的含量，與對(duì)照相比分別增加了13.3%、78.3%、12.5%；而施用菌株JXBR04制劑短期內(nèi)對(duì)土壤pH值并無顯著影響。

表2 施用菌株JXBR04制劑對(duì)毛竹土壤化學(xué)性質(zhì)的影響Table 2 Effect of added strain JXBR04 on soil chemical properties of moso bamboo seedlings.

2.3 菌株JXBR04制劑對(duì)毛竹土壤磷組分含量的影響

圖1表明：毛竹根際土壤各磷組分含量存在顯著差異，其中，鹽酸磷（HCl-P）含量最高（21.18 mg·kg-1），檸檬酸磷含量次之（3.40 mg·kg-1），氯化鈣磷（CaCl2-P）含量隨后（0.33 mg·kg-1），酶磷含量最低（0.30 mg·kg-1）。施用菌株JXBR04制劑極顯著提高了毛竹根際土壤HCl-P和CaCl2-P的含量，分別增加了46.0%和51.6%，而對(duì)土壤檸檬酸磷和酶磷含量并無顯著影響。

圖1 施用菌株JXBR04制劑對(duì)土壤磷素組分含量的影響Fig.1 Effect of strain JXBR04 inoculation on soil phosphorus fraction

2.4 菌株JXBR04制劑對(duì)毛竹土壤酶活性的影響

圖2表明：施用解磷菌劑影響了毛竹根際土壤酶活性，其中，極顯著增強(qiáng)了土壤脲酶和過氧化氫酶的活性，與對(duì)照相比分別增加了25.9%和101.0%，而酸性磷酸酶和堿性磷酸酶含量與對(duì)照相比差異不顯著。

圖2 接種JXBR04對(duì)土壤酶活性的影響Fig.2 Effect of strain JXBR04 inoculation on soil enzyme activity.

2.5 土壤磷組分與各測定指標(biāo)相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果（表3）顯示：土壤磷組分與土壤化學(xué)性質(zhì)和生長指標(biāo)相關(guān)性不盡一致，其中，土壤有效磷、毛竹生物量與CaCl2-P、HCl-P均呈極顯著正相關(guān)，土壤pH與CaCl2-P、HCl-P均呈極顯著負(fù)相關(guān)；土壤有效磷與土壤檸檬酸磷、酶磷不顯著相關(guān)，土壤酶磷與毛竹生物量不顯著相關(guān)；土壤全磷與4個(gè)磷組分均不顯著相關(guān)。

表3 土壤磷組分與各測定指標(biāo)之間的相關(guān)性Table 3 Relationships between various measurement indexes and phosphorus fraction

3 討論

毛竹主要分布我國南方丘陵山區(qū)，該地區(qū)多為酸性紅壤，土壤有效磷含量較低，使磷素成為限制亞熱帶地區(qū)毛竹林生產(chǎn)力提升的主要因子[14]。土壤磷生物有效性是反映毛竹與土壤微生物對(duì)磷需求的有效評(píng)價(jià)指標(biāo)，是維持竹林生產(chǎn)力的重要因素[21]，而適宜的土壤磷分級(jí)方法是探究磷組分特征和評(píng)估其有效性的關(guān)鍵技術(shù)方法。BBP法旨在考慮土壤根際過程的基礎(chǔ)上建立的磷素評(píng)價(jià)體系，該方法得到了眾多學(xué)者的采用。如Hoang等[22]通過對(duì)施用不同量磷肥7 a的土壤種植小麥，發(fā)現(xiàn)磷肥添加會(huì)顯著增加土壤中HCl-P和檸檬酸磷含量。蔡觀等[23]發(fā)現(xiàn)，旱地土中有效磷主要來自土壤的CaCl2-P和易礦化的酶磷，而水田土中有效磷主要來自檸檬酸磷，且不同磷組分主要受土壤pH值的影響。Wu等[24]通過測定不同林齡杉木人工林土壤磷組分含量發(fā)現(xiàn)，有機(jī)層土壤中CaCl2-P、檸檬酸磷和HCl-P均隨林齡增加而增加，礦質(zhì)層土壤中的檸檬酸磷和HCl-P隨著林齡的增加而減少，推測延長輪作周期可能是增加磷供應(yīng)的適當(dāng)措施。這些研究均證實(shí)了BBP法能較好的評(píng)價(jià)土壤不同磷形態(tài)的生物有效性，并評(píng)價(jià)其與有效磷間的關(guān)系，本文研究也證實(shí)BBP法可有效地分析我國南方毛竹土壤中磷組分特征。

土壤磷循環(huán)過程除受成土因素影響外，解磷微生物也是調(diào)控植物根際土壤磷素供應(yīng)的“工程師”[14]，以往研究結(jié)果證實(shí)，解磷微生物能提高土壤有效磷含量，促進(jìn)植物的生長，在土壤磷素循環(huán)過程中起著重要的驅(qū)動(dòng)作用[25]。本研究結(jié)果也顯示，施用菌株JXBR04制劑能顯著提高土壤有效磷養(yǎng)分，促進(jìn)毛竹實(shí)生苗的生物量增長，為今后開發(fā)竹林生物肥料提供優(yōu)良的解磷菌株。目前，解磷菌種類眾多，其潛在的溶磷機(jī)制也因菌株不同而不盡相同，主要包括酶解作用、有機(jī)酸酸解作用和釋放H+等溶解機(jī)理[26]。如部分解磷菌在生物過程中利用ATP轉(zhuǎn)換時(shí)產(chǎn)生的能量，通過質(zhì)子泵釋放H+，使pH降低，進(jìn)而增加磷的溶解和釋放[25]；有些解磷菌在土壤中不分泌有機(jī)酸，而是通過吸收Ca2+來釋放磷酸根離子來溶解難溶性磷酸鹽[27]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，施用菌株JXBR04制劑顯著提高毛竹根際土壤CaCl2-P和HCl-P含量，對(duì)酶磷和檸檬酸磷含量無影響，土壤有效磷含量與CaCl2-P和HCl-P含量顯著正相關(guān)，這些結(jié)果表明菌株JXBR04對(duì)土壤中不同難溶性磷的溶解過程具有分異性，也揭示短期施用菌株JXBR04主要是通過釋放H+溶解土壤中難溶性無機(jī)磷鹽來提高毛竹根際土壤的有效磷含量，這也驗(yàn)證了解磷微生物可以通過釋放H+溶解土壤中難溶性磷酸鹽這一解磷機(jī)制[28]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，施用解磷菌株JXBR04制劑對(duì)毛竹根際土壤中檸檬酸磷和酶磷含量未有影響，檸檬酸磷主要來自于植物根系和微生物分泌有機(jī)酸和質(zhì)子酸化土壤中等可溶性的礦物吸附態(tài)和沉積態(tài)磷，酶磷含量主要來自于易被土壤酶礦化的有機(jī)磷部分[12]，說明施用解磷真菌短期內(nèi)并未顯著影響毛竹根系和根際微生物分泌有機(jī)酸和酶活化磷的能力，也顯示施用解磷真菌JXBR04短期內(nèi)通過有機(jī)酸和酶活化土壤難溶性磷酸鹽的能力還較低，而長期施用解磷菌能否對(duì)土壤中酶磷和檸檬酸磷含量產(chǎn)生顯著影響仍需探究。

在森林生態(tài)系統(tǒng)中，土壤有機(jī)質(zhì)作為有機(jī)碳的主要匯和源，是維持土壤肥力的基礎(chǔ)，也會(huì)影響土壤磷吸附-解吸過程，在土壤磷沉淀或轉(zhuǎn)化方面起重要作用，也能為土壤微生物代謝和活動(dòng)提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[29]。本研究結(jié)果也證實(shí)了土壤有機(jī)質(zhì)與有效磷含量呈顯著正相關(guān)的結(jié)論[30]，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)質(zhì)主要和CaCl2-P、酶磷、HCl-P含量呈顯著相關(guān)，與檸檬酸磷含量并無相關(guān)性，說明有機(jī)質(zhì)主要是通過影響CaCl2-P、酶磷、HCl-P含量來影響土壤磷生物有效性；研究結(jié)果也揭示了有機(jī)質(zhì)是毛竹根際土壤不同磷組分含量變化驅(qū)動(dòng)因子之一。土壤磷生物有效性會(huì)影響植物根際土壤中其他有效養(yǎng)分含量，促進(jìn)植物根系發(fā)育和植株的生長[25]。本研究結(jié)果顯示，施用JXBR04制劑能顯著促進(jìn)毛竹根系發(fā)育和生物量，而根系生物量增加對(duì)截留土壤中磷酸根離子能力有顯著提升，也驗(yàn)證了施用解磷菌可增強(qiáng)毛竹根系截留磷酸根離子或活化土壤磷素的能力，提高土壤有效磷含量，進(jìn)而提升土壤有效養(yǎng)分供應(yīng)，增強(qiáng)毛竹葉片光合作用，從而促進(jìn)毛竹生長，這也許是解磷真菌通過調(diào)控土壤有效養(yǎng)分促進(jìn)毛竹生長的機(jī)制之一。

土壤酶參與養(yǎng)分循環(huán)，其活性反映土壤微生物活動(dòng)的強(qiáng)弱程度[31]。研究顯示，施用不同類型的肥料對(duì)土壤酶活性存在顯著差異，長期施用化學(xué)磷肥降低土壤堿性磷酸酶活性[1]，施用有機(jī)肥料可顯著提高土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性[32]，接種叢枝菌根真菌能顯著提高枸橘根際土壤酸性磷酸酶活性[33]。本研究結(jié)果顯示，施用菌劑JXBR04對(duì)土壤磷酸酶活性無顯著影響，卻顯著提高了土壤脲酶和過氧化氫酶活性。這可能與盆栽使用的基質(zhì)土為紅壤土有關(guān)，南方紅壤土普遍受到磷限制[34]，紅壤中有效磷極易被鈣、鐵、鋁等金屬離子鰲合成難溶性化合物，難以吸收利用，而土壤微生物只能通過產(chǎn)生更多磷酸酶活性加速有機(jī)磷的礦化，以滿足植物對(duì)磷的需求[35]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，施用解磷菌JXBR04短期內(nèi)對(duì)土壤酶磷含量并無顯著提高，推測解磷菌JXBR04初期并未對(duì)毛竹根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，這也詮釋了不同處理間毛竹根際土壤磷酸酶活性并無顯著差異的原因。脲酶和過氧化氫酶活性與土壤礦質(zhì)氮、有機(jī)質(zhì)含量有顯著相關(guān)性，說明該菌株對(duì)土壤礦質(zhì)氮和有機(jī)質(zhì)等有效養(yǎng)分含量均有顯著提升，而土壤中NH4+-N能被植物吸收為氮源而合成蛋白質(zhì)促進(jìn)植物的生長[36]，表明菌株JXBR04也可通過提高土壤氮供應(yīng)能力來促進(jìn)植株生長。以往研究結(jié)果顯示，部分青霉屬真菌對(duì)植物具有較好的促生作用，能顯著提高植株生物量[37]，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了菌株JXBR04可作為高效根際促生真菌用于今后竹林生物菌肥的研制。本研究揭示了土壤解磷真菌JXBR04對(duì)毛竹根際土壤磷組分含量的影響，在解磷真菌促進(jìn)毛竹生長的機(jī)制方面提供了詮釋，也為改善竹林土壤養(yǎng)分利用提供了參考，更為今后磷肥的合理施用及竹林可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

通過對(duì)毛竹實(shí)生苗施用解磷真菌JXBR04制劑溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示：施用解磷真菌JXBR04制劑顯著提高毛竹根際土壤中有效磷、礦質(zhì)氮、HCl-P和CaCl2-P組分含量，顯著增強(qiáng)土壤脲酶和過氧化氫酶活性，而對(duì)酶磷、檸檬酸磷組分含量和土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性并無影響。結(jié)果證實(shí)該菌株主要通過提高土壤CaCl2-P和HCl-P組分含量來增強(qiáng)土壤有效磷供給，促進(jìn)毛竹生長及生物量的提高。該研究可為今后竹林解磷菌肥的研制及應(yīng)用提供理論依據(jù)。