張 軍，彭軼楠，郭 琪，王沛雅，李 鑫，楊 暉

(甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“特色微生物與植物資源創(chuàng)新”甘肅省國際科技合作基地，甘肅 蘭州 730000)

構(gòu) 樹 (Broussonetia papyrifera(Linnaeus) L’Héritier ex Ventenat)是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的多年生喬木，屬于?？疲∕oraceae）構(gòu)屬(Broussonetia)。根據(jù)Angiosperm Phylogeny Group III分類系統(tǒng)，又屬固氮分支[1]。近年來，新品種雜交構(gòu)樹華構(gòu)1號因抗逆性強(qiáng)、生長速度快、產(chǎn)量高、粗蛋白質(zhì)含量高的優(yōu)點(diǎn)，被用作優(yōu)質(zhì)的木本飼料來源在全國20多個?。ㄊ校┩茝V種植；但在甘肅等西北干旱與半干旱地區(qū)，雜交構(gòu)樹的生長存在產(chǎn)量低、翌年返青率低等問題[2]。針對以上問題，研究人員一方面開展了選育適宜甘肅冷涼地區(qū)的高產(chǎn)抗寒性品系的工作；另一方面，鑒于研究表明雜交構(gòu)樹高含量的粗蛋白來源和速生可能與其內(nèi)生和根際共生的共生固氮或聯(lián)合固氮菌有密切關(guān)系[3]，可通過從雜交構(gòu)樹根際土壤中篩選本土固氮菌微生物再回接的方式，提高菌肥效果，達(dá)到增產(chǎn)的目的。因此，根據(jù)土壤環(huán)境情況分離篩選雜交構(gòu)樹優(yōu)良固氮菌株，是研制菌肥最基礎(chǔ)的前期工作。本研究旨在從甘肅地區(qū)種植的雜交構(gòu)樹根際分離篩選獲得固氮菌株，并對其固氮、促生、溶磷、生物防治等功能進(jìn)行研究，可為進(jìn)一步開發(fā)甘肅地區(qū)雜交構(gòu)樹微生物氮肥提供菌種資源。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣品

為便于研究，將根際分為遠(yuǎn)根土(距離根部1～10 cm的土壤）、根表土（距離根部0～1 cm的土壤）與根3個部位，于2019年8月在甘肅的天水（34°5′ N，105°82′ E）、蘭州（36°0′ N，103°57′ E）和張掖（38°43′ N，100°40′ E）雜交構(gòu)樹種植試驗(yàn)區(qū)，按照蛇型采樣法，各取5個點(diǎn)分別采樣，現(xiàn)場混合后將根系樣品和采用四分法保留的土壤樣品裝入無菌自封袋中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。天水、蘭州、張掖采樣區(qū)0～20 cm土層土壤的全氮含量分別為0.616、0.356、0.284 g·kg-1，硝態(tài)氮含量分別為247.00、28.80、26.05 mg·kg-1。

1.2 供試病原菌

灰霉菌（Botrytis cinereaPersoon）（Bc）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKuhn）（Rs）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumSchlecht）（Fo）、腐皮鐮孢菌（Fusarium solani(Martius) Sacco）（Fs）、茄鏈格孢（Alternaria solani(Elliset G. Martin) Sorauer）（As）由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植保所提供。

2 研究方法

2.1 固氮菌的分離與培養(yǎng)

遠(yuǎn)根土與根表土固氮菌的分離采用常規(guī)稀釋平板涂布法在Ashby培養(yǎng)基上進(jìn)行。根系固氮菌的分離：取根徑約1～10 mm的根，剪成3～5 cm的段，用自來水沖洗1～2 h，在無菌操作臺中用75%酒精浸泡1 min后，無菌水洗滌3～5次，再用0.1%的升汞浸泡3 min后，無菌水洗滌3～5次，吸干表面水分，切成5～8 mm的小段，接種于Ashby培養(yǎng)基。28℃，恒溫培養(yǎng)5～7 d，待分離的菌落長出后用平板劃線法繼續(xù)在Ashby培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。將純化好的菌株接入LB斜面上，培養(yǎng)3 d后置于冰箱4℃保藏。

2.2 固氮菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

觀察菌落形態(tài)學(xué)特征。根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明提取單菌落基因組DNA，送生物工程（上海）股份有限公司16S rDNA測序，結(jié)果與NCBI GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比對后，判定細(xì)菌種類并劃分到屬或種。應(yīng)用MEGA7.0軟件，采用鄰接法聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為1 000。

2.3 指標(biāo)測定

固氮酶活性按照微生物固氮酶（NITS）ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）說明書操作測定；溶磷能力采用定性溶磷圈法[4]和鉬銻抗定量比色法[5]測定；分泌IAA 能力采用定性顯色法和Salkowski定量比色法[5-6]測定。

2.4 固氮菌對植物病原真菌的拮抗能力

采用濾紙條法[7]研究分離到的固氮菌對植物病原真菌的拮抗能力。用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)分離得到的固氮菌，待菌體濃度達(dá)到OD600= 1時，取菌液備用。在PDA培養(yǎng)基平板中央接種直徑為7 mm的植物病原菌菌絲塊，分別進(jìn)行如下3種處理：a對照（無處理）；b無菌水濾紙條對照（距菌絲塊兩側(cè)1.5 cm位置放置用無菌水浸濕的濾紙條）；c拮抗試驗(yàn)（距菌絲塊兩側(cè)1.5 cm位置放置浸濕固氮菌菌液的濾紙條）。3種處理28℃培養(yǎng)7～10 d，觀察抑菌效果。待處理b病原菌鋪滿整個平板時，垂直濾紙條方向測量處理b與處理c病原菌的菌落直徑，計(jì)算抑制率。抑制率 =（處理b菌落直徑-處理c菌落直徑）/處理b菌落直徑 × 100%。

2.5 菌株特性綜合評價

采用熵權(quán)法[8]對分離到菌株性能進(jìn)行綜合評價。

2.6 數(shù)據(jù)處理

對獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 固氮菌菌株的分離及鑒定

經(jīng)16S rDNA測序比對發(fā)現(xiàn)，從3個試驗(yàn)區(qū)雜交構(gòu)樹根際共分離到10株固氮菌，有5株菌為3地共有，分屬同1菌株（表1）。與該屬模式菌株及最高相似性菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）表明：10株菌分屬8個屬9個種，其中，3地共有菌HTZ1、HTZ2、HTZ3、HTZ4、HTZ5分別被認(rèn)定為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend) Conn）（同源相似性98.16%，下同）、費(fèi)氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii(Scholla et Elkan) Chen）(99.82%)、阿拉伯分枝桿菌（Mycolicibacterium arabienseZhang）（98.88%）、墨西哥假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas mexicanaThierry）（97.87%）和日本假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas japonensisThierry）（98.13%）。從天水試驗(yàn)區(qū)遠(yuǎn)根土中另外分離得到的2株菌TS2、TS4，分屬纖維弧菌屬（Cellvibrio）和固氮菌屬（Azotobacter），被認(rèn)定為Cellvibrio fibrivoransMergaert（98.17%）和圓褐固氮菌（Azotobacter chroococcumBeijerinck）（99.73%）。從蘭州遠(yuǎn)根土和根表土中另外分離得到的2株菌HP5、HP10分屬腸桿菌屬（Enterobacter）和鞘氨醇桿菌屬（Sphingobium），被認(rèn)定為煙草腸桿菌（Enterobacter tabaciDuan）（99.53%）和Sphingobium abikonenseKumari（98.70%）。從張掖遠(yuǎn)根土中分離得的ZY9也屬于假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonassp.）（99.38%）。以上菌株在雜交構(gòu)樹根際的分布數(shù)量表現(xiàn)為根表土 ＞ 遠(yuǎn)根土，菌株種類數(shù)量最多的為假黃單胞菌屬，共3株，優(yōu)勢率為37.5%。3個試驗(yàn)區(qū)雜交構(gòu)樹的根內(nèi)均未分離得到固氮菌。

圖1 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的10株雜交構(gòu)樹根際固氮菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees of nitrogen fixing strains from rhizosphere constructed based on 16S rDNA gene sequence

表1 雜交構(gòu)樹根際固氮菌分離結(jié)果與菌落形態(tài)Table 1 Results and colony morphology of root-bound nitrogen-fixing bacteria from hybrid Broussonetia papyrifera

3.2 固氮、溶磷、促生、生防特性及綜合評價

表2表明：分離得到的10株固氮菌固氮酶活性存在差異，其中，HTZ4的固氮酶活性最低（130.41 IU·L-1），TS4的活性最高（184.51 IU·L-1）。所有固氮菌均無溶解無機(jī)磷的能力，僅HTZ2和TS4在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)上出現(xiàn)溶磷圈，說明這2株菌具有一定溶解有機(jī)磷（卵磷脂）的能力（圖2、表2），但二者差異不顯著，而在發(fā)酵液中有機(jī)磷的增量表現(xiàn)為TS4顯著大于HTZ2。能夠分泌IAA的固氮菌有8株，占分離獲得菌株數(shù)量的80%。HTZ4和HTZ1產(chǎn)IAA顯色反應(yīng)最明顯，說明具有較強(qiáng)的分泌IAA的能力，分泌量分別達(dá)44.62、36.52 μg·mL-1，與其他菌株差異極顯著；HTZ4菌液IAA的分泌量比HP10的高出約20倍（表2）。

表2 固氮菌固氮酶活性、溶磷和產(chǎn)IAA能力的檢測結(jié)果Table 2 Results of activity, dissolved phosphorus and IAA production capacity of nitrogen-fixing bacteria

圖2 菌株HTZ2（A）和TS4（B）在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上的解磷能力Fig.2 Phosphorolysis ability of strains HTZ2（A）and TS4（B）on Montana organophosphate medium

10株固氮菌對不同植物病原菌的拮抗作用不同（表3、圖3、4）。所有菌株對Bc均無拮抗作用，除HTZ2、TS4和TS2對另外4種供試病原菌也無抑制效果或效果微弱外，其余7株菌分別對至少2種以上病原菌有一定的抑制作用，其中，HP5、HP10、HTZ4、ZY9對As、Fs、Fo均有拮抗作用，HTZ4、HP5分別對As、Fs的抑菌率最大，分別為50.00%、47.37%，其次為HP10，對As、Fs抑制率分別為45.83%、44.44%；HP5、ZY9對Rs也有拮抗作用。

圖3 HP5菌株與部分病原菌的拮抗試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Antagonistic test results of the HP5 strain against some pathogenic fungi

表3 固氮菌與植物病原菌的拮抗作用Table 3 Results of antagonism between nitrogen-fixing bacteria and plant pathogenic fungi

通過對分離得到的10株固氮菌進(jìn)行固氮、溶磷、分泌生長素、抑菌特性測試結(jié)果表明：各菌株對不同測試指標(biāo)表現(xiàn)各異，其中，TS4、HTZ2 具有固氮、溶磷、分泌IAA的能力，但不具備抑制供試病原菌的能力；HP5、HTZ4、HTZ5、ZY9、HP10除無溶磷能力外，具有不同程度的固氮、分泌IAA、抑制病原菌Fs、As、Fo、Rs的作用，而TS2具有較強(qiáng)的固氮能力。為此，對10株固氮菌的上述4個特性進(jìn)行了綜合評價（表4），排名前5位的菌株為TS4、HP5、ZY9、HTZ4和HTZ5。

表4 固氮菌特性綜合評價結(jié)果Table 4 Comprehensive evaluation results of nitrogen-fixing bacteria characteristics

圖4 HP10菌株與部分病原菌的拮抗試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Antagonistic test results of the HP10 strain against some pathogenic fungi

4 討論

聯(lián)合固氮菌不同于具有專一宿主植物（如豆科）的共生固氮菌（如根瘤菌），大多聚集在植物根表而在自然生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在[9]，除具有固氮能力外，還可通過分泌生長激素、溶磷、增強(qiáng)抗病性和抗逆性等間接作用促進(jìn)植物生長[10]。目前，利用聯(lián)合固氮菌調(diào)控植物微生態(tài)環(huán)境已應(yīng)用在玉米[11]、甘蔗[12]等作物上，其生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益潛力前景廣闊。本研究對雜交構(gòu)樹根際聯(lián)合固氮菌的分離屬首次。從甘肅3個雜交構(gòu)樹種植試驗(yàn)區(qū)共分離到分屬8個屬的固氮菌，以假黃單胞菌屬居多，與通過高通量測序得出構(gòu)樹根際微生物以假單胞菌屬數(shù)量最多的結(jié)果不一致[3]，這可能與雜交構(gòu)樹生長年限和取材地域的差異有關(guān)。分離得到的固氮菌菌株在根際的分布數(shù)量表現(xiàn)為根表土 ＞ 遠(yuǎn)根土 ＞ 根，這一規(guī)律與從玉米和禾草根際分離促生菌[13-14]得到的結(jié)果一致；但3地根中沒有分離到固氮菌，又與前二者能夠在根中獲得菌株不一致，這可能與各自的繁殖方式不同有關(guān)，前二者主要進(jìn)行種子繁殖，存在一定內(nèi)源微生物，雜交構(gòu)樹為無性繁殖組培苗，受微生物侵染的幾率較小，煉苗后移植大田的種植年限也較短（3地種植期均為2 a）。另外，黃酮類化合物是雜交構(gòu)樹的主要藥用成分，也是微生物向雜交構(gòu)樹根際定殖的重要信號物質(zhì)[3]，幼齡期雜交構(gòu)樹根中黃酮類物質(zhì)的積累明顯不足，有可能造成微生物向根表移動而尚未侵入內(nèi)根際；但也不能排除分離方法的局限性是根內(nèi)未分離出菌株的原因之一。上述推測需后續(xù)開展試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

本研究中，5株3地共有菌均來自根表土，說明離雜交構(gòu)樹根系較近土壤中的微生物種類可能只與根中信號傳導(dǎo)物質(zhì)有關(guān)；而3地特有種，除HP10以外均來自遠(yuǎn)根土，說明較遠(yuǎn)土壤中的微生物種類可能受3地氣候、土壤理化性質(zhì)、類型及耕作措施等因素的影響較大。有研究表明，土壤含氮量是影響植物固氮菌種類和數(shù)量的重要因素[15-16]，高水平的氮素不利于固氮菌菌群的生長。本研究中，從天水試驗(yàn)區(qū)根際土壤中獲得的固氮菌種類與數(shù)量并未因土壤中全氮和硝態(tài)氮水平與蘭州、張掖試驗(yàn)區(qū)差異較大而呈明顯差異，差異僅表現(xiàn)為特有種，可能原因是3地試驗(yàn)區(qū)土壤含氮量整體偏低而不足以產(chǎn)生“氮阻遏”效應(yīng)。雜交構(gòu)樹根部雖不形成根瘤，但從根際分離到了根瘤菌，說明根瘤菌也可定殖于非豆科植物根際固氮[17]。

從菌株特性看，本研究中固氮、溶磷、分泌IAA和抑制植物病原菌能力較強(qiáng)的菌株在屬種的分布無較強(qiáng)規(guī)律性，具有一定的普遍性，且大多分離自根表土，離根系較近，表明這些菌株的活性與雜交構(gòu)樹根際分泌物的相互作用也有一定相關(guān)性[18]。本研究應(yīng)用熵權(quán)法篩選出了綜合性能較強(qiáng)的5株固氮菌，但排名靠后的菌株在某些特性方面的表現(xiàn)也較優(yōu)異，如鞘氨醇桿菌屬菌株HP10，在本研究中表現(xiàn)為較高的固氮酶活性和抑制腐皮鐮孢菌、茄鏈格孢的能力，該屬菌株在降解芳香族化合物、耐鹽堿、青貯中蛋白水解[19-21]等方面都有應(yīng)用，具有多種生物學(xué)功能。因此，可進(jìn)一步發(fā)掘其應(yīng)用范圍或研究與其他菌株的聯(lián)合應(yīng)用。另外，雜交構(gòu)樹抗逆性強(qiáng)，耐鹽堿[22]，后續(xù)可在鹽堿地種植的雜交構(gòu)樹根際發(fā)掘耐鹽、耐堿固氮菌株。

5 結(jié)論

從甘肅境內(nèi)3個種植區(qū)的雜交構(gòu)樹根際分離獲得10株固氮菌，并分析了其固氮、溶磷、分泌IAA和抑制植物病原菌的特性，為西北半干旱地區(qū)雜交構(gòu)樹根際微生物深入研發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。