李亞?wèn)|，張紅霞

1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院臨夏診療區(qū)，甘肅 臨夏 731100；2.解放軍西寧聯(lián)勤保障中心藥品儀器監(jiān)督檢驗(yàn)站，甘肅 蘭州 730050

關(guān)節(jié)止痛膏處方來(lái)源于1991 年《中藥成方制劑標(biāo)準(zhǔn)》，作為一種局部外用橡膠膏，是目前治療相關(guān)病癥的常用藥物［1-7］。其主要成分包括辣椒流浸膏、顛煎流浸膏、薄荷素油、水楊酸甲酯、樟腦以及鹽酸苯海拉明［8］，所用基質(zhì)包括橡膠、氧化鋅、松香、凡士林、羊毛脂等［9-10］。關(guān)節(jié)止痛膏具有活血散瘀，溫經(jīng)鎮(zhèn)痛的功效，在臨床上主要用于寒濕瘀阻經(jīng)絡(luò)所致的風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛及關(guān)節(jié)扭傷［11-12］。

《中國(guó)藥典》2015 年版四部非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查法［13］，對(duì)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、微生物限度用培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、方法適用性檢查等各方面都進(jìn)行了調(diào)整，《中國(guó)藥典》2010 年版控制菌檢查中使用的增菌培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯、膽鹽乳糖培養(yǎng)基均被胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基替代，為了確認(rèn)所采用的新培養(yǎng)基適合于關(guān)節(jié)止痛膏的控制菌的檢查，本研究對(duì)其檢查方法進(jìn)行了方法適用性試驗(yàn)［14］。作為傳統(tǒng)中藥制劑，關(guān)節(jié)止痛膏目前在國(guó)內(nèi)共有48個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)［15］，涉及的生產(chǎn)企業(yè)多達(dá)30 多家，本研究收集了6 家生產(chǎn)企業(yè)共17 個(gè)批號(hào)的樣品進(jìn)行試驗(yàn)，以期對(duì)其控制菌的檢查方法進(jìn)行統(tǒng)一，確認(rèn)此方法適合關(guān)節(jié)止痛膏中控制菌的測(cè)定，并確保該方法的有效性和試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性［16］。

按照《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則1106 的規(guī)定，關(guān)節(jié)止痛膏每10 cm2不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ME4002E/02 電子分析天平［梅特勒-托利多（上海）有限公司］；LDZX-60KBS 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；UPS 醫(yī)療純水機(jī)（成都優(yōu)普凈化科技有限公司）；JJNYI 霉菌培養(yǎng)箱（上海虹浦儀器廠）；HW-B-2 培養(yǎng)干燥箱（廈門(mén)醫(yī)療儀器廠）；PYX-DH 電熱恒溫培養(yǎng)箱（國(guó)光醫(yī)療器械廠）；H.H.S 電熱恒溫水浴鍋（江蘇醫(yī)療器械廠）。

1.2 培養(yǎng)基和稀釋劑

pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)：20160426）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20160113）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20170619）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20160328）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)：20160204）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20160505）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：20160407）均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 菌種

試驗(yàn)菌種包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］，上述兩種菌種均為第3 代，均由甘肅省食品藥品檢定研究院提供。

1.4 樣品

本試驗(yàn)所用的樣品信息見(jiàn)表1。

表1 關(guān)節(jié)止痛膏來(lái)源信息

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

將銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24 h，取上述兩種菌的培養(yǎng)物，用pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成每1 mL 含菌數(shù)小于100 cfu 的菌懸液。

2.2 控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查

2.2.1 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基檢查用涂布法分別接種不大于100 cfu 的銅綠假單胞菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征一致，說(shuō)明被檢培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力符合規(guī)定；涂布不少于100 cfu 的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)72 h，結(jié)果顯示，兩種培養(yǎng)基上均未有菌生長(zhǎng)，說(shuō)明被檢培養(yǎng)基的抑制能力符合規(guī)定。

2.2.2 甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基檢查用涂布法分別接種不大于100 cfu 的金黃色葡萄球菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征一致，說(shuō)明被檢培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力和指示特性符合規(guī)定；涂布不少于100 cfu 的大腸埃希菌于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)72 h，結(jié)果顯示，兩種培養(yǎng)基上均未有菌生長(zhǎng)，說(shuō)明被檢培養(yǎng)基的抑制能力符合規(guī)定。

2.3 供試液的制備

取供試品2 貼，去掉貼膏劑的保護(hù)層，放置在無(wú)菌操作臺(tái)上，粘貼面朝上，用無(wú)菌紗布覆蓋粘貼面，剪碎，將碎片置于含10%聚山梨酯80 的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液140 mL 中，于水浴加熱45 ℃振搖30 min，混勻，作為1∶10 供試液。

2.4 銅綠假單胞菌檢查方法適用性試驗(yàn)

試驗(yàn)組：取1∶10 供試液10 mL 和1 mL（含菌數(shù)<100 cfu）的銅綠假單胞菌菌懸液接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻。

供試品對(duì)照組：取1∶10 供試液10 mL，稀釋液代替菌液，同試驗(yàn)組操作。

陽(yáng)性對(duì)照組：取不含聚山梨酯80 的稀釋液（pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）取代供試液，同試驗(yàn)組操作。

陰性對(duì)照組：取2 瓶100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，其中一瓶作為陰性對(duì)照1；另一瓶加入稀釋劑（含10%聚山梨酯80 的pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）作為陰性對(duì)照2。

上述各組在35 ℃培養(yǎng)24 h 后，取培養(yǎng)物分別劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，在35 ℃培養(yǎng)，試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組24 h 后有菌落生長(zhǎng)，供試品組與陰性對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)72 h。若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為銅綠假單胞菌；若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判未檢出銅綠假單胞菌。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 銅綠假單胞菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 金黃色葡萄球菌檢查方法適用性試驗(yàn)

試驗(yàn)組：取1∶10 供試液10 mL 和金黃色葡萄球菌菌懸液1 mL（含菌數(shù)<100 cfu）接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻。

供試品對(duì)照組：取1∶10 供試液10 mL，稀釋液代替菌液，同試驗(yàn)組操作。

陽(yáng)性對(duì)照組：取不含聚山梨酯80 的稀釋液（pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）取代供試液，同試驗(yàn)組操作。

陰性對(duì)照組取2 瓶100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，其中一瓶作為陰性對(duì)照1；另一瓶加入稀釋劑（含10%聚山梨酯80 的pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）作為陰性對(duì)照2。

上述各組在35 ℃培養(yǎng)24 h 后，取培養(yǎng)物分別劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，在35 ℃培養(yǎng)，試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組24 h后有菌落生長(zhǎng)，供試品組與陰性對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)72 h。若甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為金黃色葡萄球菌；若甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判未檢出金黃色葡萄球菌。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 金黃色葡萄球菌檢查方法的驗(yàn)證結(jié)果

表2 及表3 結(jié)果顯示，按照《中國(guó)藥典》2015年版的規(guī)定進(jìn)行控制菌方法適用性檢查時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)組和試驗(yàn)組的試驗(yàn)菌都生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照組均無(wú)菌生長(zhǎng)，表明17 批樣品在該條件下對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，說(shuō)明采用該法進(jìn)行金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢查可行。

3 討論

根據(jù)《中國(guó)藥典》2015 年版四部非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查法中貼膏劑供試品的制備通則“取供試品，去掉防黏層，將粘貼面朝上放置在無(wú)菌玻璃器皿上，在粘貼面上覆蓋一層無(wú)菌紗布，避免貼膏劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80 或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少30 min。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10 倍系列稀釋”［13］，為了簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，本試驗(yàn)最初按照藥典規(guī)定，采取“取樣品100 cm2，加入含30%無(wú)菌十四烷酸異丙酯的pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，45℃保溫振搖30 min”的方法，除了發(fā)現(xiàn)有些樣品存在供試品溶解不完全的情況外，部分樣品還出現(xiàn)了油水分層不明顯的狀況，需要增加萃取的步驟。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，若將最后把加入的表面活性劑“無(wú)菌十四烷酸異丙酯”改為“聚山梨酯80”濃度確定為10%，即稀釋液采用“含10%聚山梨酯80 的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液”，在此稀釋液中，供試品溶解較為完全，油水分層明顯，可以取水層作為1∶10 供試液，同時(shí)為了使供試品充分溶解，供試液制備方法中還加入了“將樣品剪碎”的步驟。

綜上所述，最后確定的供試液制備方法為“取供試品2 貼，去掉貼膏劑的保護(hù)層，放置在無(wú)菌操作臺(tái)上，粘貼面朝上，用無(wú)菌紗布覆蓋粘貼面，剪碎，將碎片置于含10%聚山梨酯80 的pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液140 mL 中，于水浴加熱45 ℃振搖30 min，混勻，作為1∶10 供試液”。

本實(shí)驗(yàn)采用《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則1106 進(jìn)行關(guān)節(jié)止痛膏控制菌微生物限度檢查方法的分析，該試驗(yàn)方法操作步驟簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高，且具有儀器簡(jiǎn)單、快速、方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。