張改清 陰彩霞

(1呂梁學院化學化工系，呂梁 033000)

(2山西大學分子科學研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006)

硫醇主要包括脂肪硫醇和苯硫醇。半胱氨酸(cysteine，Cys)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)等脂肪硫醇在生理過程中起著非常重要的作用[1-7]。作為硫醇的一種，苯硫酚被廣泛用于農藥生產、化學合成、制藥工程和工業(yè)生產中的重要中間體，其使用不可避免地面臨高毒性和高污染的重要問題[8-9]。苯硫酚及其衍生物具有高毒性，苯硫酚對魚類的半致死劑量(LC50)范圍為0.01～0.4 mmol·L-1[10]，對小鼠的LC50 為2.15～46.2 mg·kg-1[11]。生物體長期接觸硫酚會嚴重損害中樞神經(jīng)和其他神經(jīng)系統(tǒng)，導致呼吸急促、肌肉無力、后肢麻痹、昏迷甚至死亡[12-13]。因此，考慮到苯硫酚對生物和環(huán)境的不良影響，開發(fā)檢測苯硫酚的簡單、靈敏和具有選擇性的方法是非常重要的。

由于具有成本低、靈敏度高以及生物相容性好等優(yōu)點，熒光方法已在檢測和標記中得到廣泛應用，是一種非常有前景的工具[14]。由于異佛爾酮衍生物類熒光染料具有給體-π-受體(D-π-A)結構，其超快的分子內轉移電荷(ICT)引起大的斯托克斯位移[15]，該類染料已經(jīng)開始應用于各類熒光探針的設計[16-17]。

到目前為止，許多苯硫酚熒光探針已經(jīng)被設計、合成出來[18-20]，但是大多數(shù)熒光探針仍是短波長發(fā)射。我們用2，4-硝基苯氟苯修飾了二氰基異佛爾酮衍生物，用作熒光開關，以獲得用于檢測苯硫酚的探針YC1。由于2，4-二硝基苯強的吸電子能力導致的部分的光致電子轉移(PET)過程，探針YC1基本上具有較弱的熒光。苯硫酚通過芳香族親核取代反應機理與探針YC1 發(fā)生反應，2，4-二硝基苯作為離去基團離去，隨后釋放熒光化合物2(發(fā)射峰主要在594 nm處)，熒光響應信號增強(turn-on)，計算得到相應的檢出限為0.65 μmol·L-1。此外，探針被成功應用于HeLa細胞內4-甲基苯硫酚的成像。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀 器

所用儀器有ME204E 電子天平、FE20-FIve Easy PlusTM酸度計、Bruker AVANCE-600 MHz 核磁共振儀、LTQ-MS(Thermo)電噴霧質譜、U-3900 紫外-可見分光光度計、F-7000 熒光分光光度計、TCS SP5 激光掃描共聚焦顯微鏡。

1.1.2 試 劑

異佛爾酮、丙二腈、哌啶、冰醋酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲醛(香草醛)、2，4-二硝基氟苯和4-甲基苯硫酚等均為分析純，購自上海阿拉丁試劑有限公司。4-甲基苯硫酚以及探針YC1 的儲備溶液用二甲亞砜(DMSO)溶液作為溶劑配制得到。

1.2 探針YC1的制備

探針YC1 的合成路線及響應機理如Scheme 1所示，探針YC1通過3步反應即可得到。

化合物1 和化合物2 根據(jù)文獻報道的方法合成[21]。

探針YC1 的合成：向化合物2(640 mg，2.0 mmol)與N，N-二甲基甲酰胺(DMF，10 mL)的混合溶液中加入1-氟-2，4-二硝基苯(391 mg，2.1 mmol)和K2CO3(548 mg，4 mmol)，室溫攪拌2 h。反應過程通過TLC 監(jiān)測。待反應完成后，除去溶劑。所得粗產品通過硅膠柱色譜法(乙酸乙酯/石油醚，1∶3，V/V)純化，得到深黃色固體YC1(613 mg，產率為63%)。

結構表征：1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ8.90(d，J=13.2 Hz，1H)，8.41(d，J=9.2 Hz，1H)，7.67(d，J=21.9 Hz，1H)，7.59～7.47(m，1H)，7.45～7.30(m，3H)，7.03(d，J=9.3 Hz，1H)，6.93(s，1H)，3.83(d，J=19.3 Hz，3H)，2.63(d，J=18.8 Hz，2H)，2.57(s，2H)，1.04(s，6H)。13C NMR(151 MHz，DMSO-d6)：δ170.8，156.1，155.4，151.4，142.2，141.6，138.8，137.0，136.4，130.8,130.0,123.6，123.1，122.5，122.3，118.1，114.3，113.5,112.6,77.2,56.6，42.8，38.7，32.2，27.9。ESI-MSm/z：[YC1-H]-即[C26H22N4O6-H]-計算值485.146 1；實測值485.147 0。元素分析按C26H22N4O6的計算值(%)：C 64.19，H 4.56，N 11.52。實測值(%)：C 64.15，H 4.57，N 11.54。

Scheme 1 Synthetic route of probe YC1

1.3 細胞成像

將HeLa細胞接種在激光共聚焦培養(yǎng)皿中，并將細胞于37 ℃、CO2體積分數(shù)5%的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h以進行熒光成像實驗。熒光成像通過共聚焦激光掃描顯微鏡進行。在種有HeLa 細胞的激光共聚焦培養(yǎng)皿中用探針YC1(5 μmol·L-1)預處理20 min。外源性4-甲基苯硫酚成像：再孵入20 μmol·L-14-甲基苯硫酚孵育30 min，用458 nm 激發(fā)獲得在紅色通道中的活細胞激光共聚焦成像。

2 結果與討論

2.1 探針YC1的設計以及響應機制

考慮到二氰基異佛爾酮作為熒光母體是一種典型的基于ICT 的熒光團，具有長波長熒光發(fā)射、大的斯托克斯位移和良好的光穩(wěn)定性等優(yōu)勢，我們選擇二氰基異佛爾酮作為設計探針的熒光團，通過一個醚鍵，將二氰基異佛爾酮熒光母體與2，4-二硝基苯基作為識別位點的兩部分連接成一體。由于2,4-二硝基苯強的吸電子能力導致的部分的PET 過程，探針YC1 基本上是較弱的熒光。苯硫酚中的羥基具有強的親核性，通過芳香族親核取代反應機理與探針YC1 發(fā)生反應，2，4-二硝基苯作為離去基團離去，隨后釋放熒光化合物2(主要是酚形式，發(fā)射峰主要在594 nm 處)，熒光響應信號增強(turn-on)。Scheme 2 顯示了YC1 探針對4-甲基苯硫酚的檢測機理。通過質譜法驗證了該機理。在圖S4(Supporting information)的核磁氫譜中，我們找到了反應后熒光母體上活潑氫的化學位移δ=9.60。核磁結果支持了Scheme 2 中的反應機理。此外，由質譜(圖S5)結果發(fā)現(xiàn)，[YC1+4-methylthiophenol-H]-(即[C26H22N4O6+C7H8S-H]-)的m/z計算值319.145 2，與實測值(319.1450 7)吻合，這也支持了Scheme 2 中的反應機理。

Scheme 2 Response mechanism of probe YC1 for detecting 4-methylthiophenol

2.2 探針YC1識別4-甲基苯硫酚的UV-Vis吸收光譜研究

圖1 探針YC1檢測4-甲基苯硫酚的UV-Vis吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of YC1 probe for detecting 4-methylthiophenol

探針YC1 檢測4-甲基苯硫酚的UV-Vis 吸收光譜如圖1 所示。當200 μmol·L-1的4-甲基苯硫酚加入到含有10 μmol·L-1探針YC1 的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)/DMSO(1∶1，V/V，pH=7.4)體系中，隨著時間的增加，405 nm 處的吸收峰值逐漸下降且紅移至442 nm 處，同時在598 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰且峰值逐漸升高，同時，溶液顏色由淺黃色變?yōu)樯铧S色。二氰基異佛爾酮類熒光團的pKa較高(7.90)，在生理條件下會發(fā)生部分解離，從而生成2種熒光團：酚形式(主要形式)和酚鹽形式(次要形式)。405 nm 為探針自身的吸收峰。當與苯硫酚反應后，生成帶有羥基的二氰基異佛爾酮類熒光團，部分解離生成2 種形式的熒光團的酚形式(主要形式)和酚鹽形式(次要形式)，UV-Vis 光譜中442 nm 為酚形式的吸收，598 nm為酚鹽形式的吸收。這說明探針YC1 與4-甲基苯硫酚反應生成了新的化合物，與前述核磁與質譜的結果一致。

2.3 探針YC1識別4-甲基苯硫酚的熒光光譜研究

探針YC1檢測4-甲基苯硫酚的熒光光譜如圖2所示。探針YC1 在該體系中有較弱的熒光。當30 μmol·L-1的4-甲基苯硫酚加入到含有5 μmol·L-1探針YC1的PBS/DMSO(1∶1，V/V，pH=7.4)體系中，隨著時間的增加，594 nm 處出現(xiàn)明顯的熒光強度增強。這說明探針YC1 能夠用來識別4-甲基苯硫酚，且具有明顯的熒光增強(turn-on)響應。

2.4 探針YC1識別4-甲基苯硫酚的動力學研究

圖2 探針YC1檢測4-甲基苯硫酚的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of YC1 probe for detecting 4-methylthiophenol

探針YC1 檢測4-甲基苯硫酚的動力學研究使用的是熒光光譜法，結果如圖3 所示。對探針YC1持續(xù)光照1.5 h 之后，熒光強度基本不變，說明探針YC1 具有一定的光穩(wěn)定性。當不同濃度的4-甲基苯硫酚(0、5、10、15、20、25 和30 μmol·L-1)加入到含有5 μmol·L-1探針YC1 的PBS/DMSO(1∶1，V/V，pH=7.4)體系中，可以發(fā)現(xiàn)4-甲基苯硫酚的濃度為20 μmol·L-1，時間約90 min 時，熒光響應信號基本達到一個動態(tài)平衡狀態(tài)(激發(fā)波長為420 nm，發(fā)射波長為594 nm，激發(fā)狹縫寬度/發(fā)射狹縫寬度：5 nm/5 nm)。

圖3 探針YC1檢測4-甲基苯硫酚的動力學Fig.3 Kinetic of detecting 4-methylthiophenol by YC1 probe

2.5 探針YC1識別4-甲基苯硫酚的pH體系研究

為了考察探針YC1 識別4-甲基苯硫酚的有效pH 范圍，我們研究了不同pH 值(2～10)對探針YC1(5 μmol·L-1)和YC1(5 μmol·L-1)+4-甲基苯硫酚(20 μmol·L-1)熒光性質的影響。從圖4 中，我們可以發(fā)現(xiàn)強酸以及強堿條件對探針YC1 本身的熒光強度沒有影響。而探針YC1 檢測4-甲基苯硫酚時，在pH=6.0～8.0范圍內熒光響應信號明顯。這一結果表明，該探針能夠應用于生理環(huán)境下檢測苯硫酚。

圖4 不同pH值下YC1(5 μmol·L-1)和YC1(5 μmol·L-1)+4-甲基苯硫酚(20 μmol·L-1)的熒光強度Fig.4 Fluorescence intensity of YC1(5 μmol·L-1)and YC1(5 μmol·L-1)+4-methylthiophenol(20 μmol·L-1)under different pH values

2.6 探針YC1識別4-甲基苯硫酚的選擇性研究

為了研究探針YC1 的選擇性，采用熒光光譜考察了探針YC1 對4-甲基苯硫酚的識別性能。在含有5 μmol·L-1探針YC1 的PBS/DMSO(1∶1，V/V，pH=7.4)體系中，先后分別加入100 μmol·L-1各種分析物與20 μmol·L-14-甲基苯硫酚，分別進行檢測。各種分析物分為2 組，第1 組如圖5a 所示，第2 組如圖5b所示?？梢钥闯?，探針與其他分析物不能引起YC1在594 nm 處的熒光強度增強，而只有在4-甲基苯硫酚(20 μmol·L-1)存在的情況下，YC1 在594 nm 處的熒光強度才能增強。這些結果表明，探針YC1 可以較好地選擇性識別4-甲基苯硫酚，其他分析物的存在不干擾探針YC1對4-甲基苯硫酚的檢測。

2.7 探針YC1識別4-甲基苯硫酚的檢測限研究

為了研究探針YC1 對4-甲基苯硫酚的靈敏度，我們將不同濃度的4-甲基苯硫酚(2～10 μmol·L-1)分別加入到含有5 μmol·L-1探針YC1 的3 種不同混合體系中，測試其相應的熒光強度。根據(jù)594 nm 處的熒光強度變化值與對應的4-甲基苯硫酚濃度得到工作曲線(Y=Ac+B)，c的單位為μmol·L-1，測量時的激發(fā)波長為420 nm，結果如圖6 所示。根據(jù)IUPAC規(guī)定的檢測限公式：LOD=kSb/m[22](其中k為與置信度有關的常數(shù)，IUPAC建議取k=3，Sb為空白標準偏差，m為分析標準曲線在低濃度范圍內的斜率)，可以算出探針YC1 在池塘水、自來水和PBS 中對4-甲基苯硫酚的檢測限分別為0.19、0.38和0.65 μmol·L-1，。

圖5 探針YC1對4-甲基苯硫酚的選擇性及分析物競爭性Fig.5 Selectivity and analyte competitive of YC1 probe to 4-methylthiophenol

圖6 在不同水樣中探針YC1熒光強度與4-甲基苯硫酚濃度的線性相關:(a)池塘水、(b)自來水和(c)PBSFig.6 Linear correlation between fluorescence intensity of probe YC1 and 4-methylthiophenol concentration in different water samples:(a)pond water,(b)tap water and(c)PBS

2.8 探針YC1識別4-甲基苯硫酚的細胞成像研究

探針YC1 在活細胞內對4-甲基苯硫酚的成像標記能力通過激光共聚焦顯微鏡來評估。圖7所示的是將5 μmol·L-1探針孵育到HeLa 細胞中，20 min后沒有明顯的熒光信號；接著將5 μmol·L-1探針孵育到HeLa 細胞中，再孵入20 μmol·L-1的4-甲基苯硫酚，30 min 后產生明顯的紅色熒光。細胞成像實驗表明探針具有較好的細胞膜通透性，并且探針可以用來標記活細胞中外源性的4-甲基苯硫酚。

圖7 探針YC1對4-甲基苯硫酚的激光共聚焦成像:只有探針的熒光圖(a1)和明場圖(a2);外源性4-甲基苯硫酚響應熒光圖(b1)和明場圖(b2)Fig.7 Confocal laser imaging of probe YC1:fluorescence image(a1)and bright field image(a2)of the probe;fluorescence image(b1)and bright field image(b2)of exogenous 4-methylthiophenol response

3 結 論

我們選擇具有強吸電子基的2，4-二硝基苯與二氰基異佛爾酮衍生物連接，設計并合成了基于二氰基異佛爾酮的熒光探針YC1 用于特異性檢測苯硫酚。苯硫酚通過芳香族親核取代機制與探針YC1 發(fā)生反應，導致2，4-二硝基苯部分離去，隨后釋放具有明顯熒光發(fā)射的化合物2，熒光響應信號(594 nm)增強。在PBS/DMSO 的體系中，YC1對苯硫酚的檢出限為0.65 μmol·L-1。該方法是基于探針YC1 對4-甲基苯硫酚的識別具有熒光增強(turn-on)的性質。此外，探針還可以在HeLa細胞中實現(xiàn)對外源性4-甲基苯硫酚的熒光成像。該檢測方法可以為今后的苯硫酚檢測提供一個有用的工具與手段。

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