陳旋，李香劍，吳丹，楊延

（1.滇西科技師范學(xué)院 生物技術(shù)與工程學(xué)院，云南臨滄 677000；2.云南省紅茶工程技術(shù)研究中心，云南臨滄 677000）

云南是我國(guó)重要的咖啡產(chǎn)地，種植面積和產(chǎn)量均占全國(guó)的99%以上，而云南臨滄由于具有良好的氣候條件和生態(tài)環(huán)境，地處全球咖啡最佳種植區(qū)域之一，被認(rèn)為是我國(guó)最適宜發(fā)展咖啡產(chǎn)業(yè)的地區(qū)之一[1]。目前，臨滄咖啡種植面積已突破4 萬(wàn)公頃，產(chǎn)量近2 萬(wàn)噸，而且產(chǎn)量有逐年增加的趨勢(shì)。咖啡生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的咖啡種殼加工廢棄物，每1 t 咖啡漿果中大約有60 kg 咖啡種殼，粗纖維含量為297～754 g/kg 干物[2]。目前，云南咖啡種殼廢棄物以燃料的形式通過(guò)焚燒被利用。近年來(lái)，許多科學(xué)工作者致力于研究咖啡加工廢棄物的潛在用途?？Х燃庸U棄物應(yīng)用于牲畜飼料中，由于種殼中蛋白質(zhì)含量很低，而木質(zhì)素含量高，很難消化，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不高[3-5]。

通過(guò)將咖啡加工廢棄物咖啡種殼利用酸水解糖化的方法適當(dāng)處理纖維素的原理，將纖維素水解為還原糖，為后續(xù)生物發(fā)酵制備燃料乙醇提供一定參考，酸水解糖化是發(fā)酵制備乙醇的重要前提步驟[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

咖啡種殼，取自云南省臨滄市云縣幸福鎮(zhèn)咖啡廠咖啡豆?jié)穹庸ず罂Х葟U棄物。去除種殼中的咖啡豆，密封于4 ℃冰箱貯藏，其中粗蛋白（7.31±0.05）%，粗脂肪（2.67±0.04）%，灰分（8.15±0.01）%，水分（8.98±0.08）%，粗纖維（20.44±0.06）%，總糖（18.4±0.05）%。

1.2 試劑

3,5-二硝基水楊酸（DNS）、丙三醇、葡萄糖，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZF 50KB-LLL 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；754 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TDL-4 型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；HHS 型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 咖啡種殼水解液的制備

稱取10 g 咖啡種殼于水解瓶中，加入適量稀硫酸，一定溫度、時(shí)間條件下進(jìn)行超聲水解后，3 000 r/min離心5 min，收集上清液，即為咖啡種殼水解液。

1.4.2 咖啡種殼水解率的測(cè)定

采用DNS 比色法測(cè)定水解液中還原糖的含量。取咖啡種殼水解液1 mL 于25 mL 帶刻度的玻璃試管中，加蒸餾水稀釋至5 mL，加2 mL DNS 溶液，沸水浴2 min 顯色。迅速冷卻至室溫，加蒸餾水使體積達(dá)到25 mL，混合均勻，測(cè)定540 nm 處吸光值。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出測(cè)定樣品中還原糖含量。試驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=47.543x-0.209 8（R2=0.999 2）。

咖啡種殼水解液中還原糖含量根據(jù)公式（1）計(jì)算。

式（1）中，m為還原糖含量，mg；X為樣品OD540值對(duì)應(yīng)還原糖含量，mg；n為待測(cè)液的稀釋倍數(shù)；V為待測(cè)液體積，mL；v為測(cè)定時(shí)取用體積，mL。

咖啡種殼水解率根據(jù)公式（2）計(jì)算。

式（2）中，a為還原糖質(zhì)量；m為咖啡果皮質(zhì)量；ω為含水量。

1.4.3 單因素試驗(yàn)

稱取10 g 咖啡種殼于水解瓶中，確定咖啡種殼水解糖化的單因素試驗(yàn)條件。在初始硫酸濃度為3.00%、液固比為20∶1（mL∶g）、水解溫度為100 ℃、水解時(shí)間為1.00 h的條件下，分別考察硫酸濃度為0%、2.00%、3.00%、5.00%、10.00%時(shí)；液固比為2 ∶1、5 ∶1、10 ∶1、12 ∶1、15 ∶1、20 ∶1 時(shí)；溫度為80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃、130 ℃時(shí)；水解時(shí)間為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min 時(shí)對(duì)咖啡種殼水解糖化的影響。

1.4.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取硫酸濃度、液固比、溫度、時(shí)間4 個(gè)因素，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)咖啡種殼水解糖化的工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素及水平編碼如表1 所示。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平表

1.4.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0 數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 硫酸濃度對(duì)咖啡種殼酸水解糖化的影響

如圖1 所示，隨著硫酸濃度的增高，咖啡種殼的水解率也增高，在硫酸濃度為3.00%時(shí)，水解率達(dá)到最高值12.198%。當(dāng)稀硫酸低于3.00%，咖啡種殼中纖維素的結(jié)構(gòu)不容易被破壞，纖維素不能進(jìn)行充分水解[6]。當(dāng)稀硫酸高于3.00%，可能由于糖化類(lèi)化合物之間發(fā)生了復(fù)合反應(yīng)，導(dǎo)致還原糖含量降低[7]。因此，選取3.00%為最佳硫酸濃度。

圖1 硫酸濃度對(duì)水解率的影響

2.1.2 液固比對(duì)咖啡種殼酸水解糖化的影響

如圖2 所示，隨著液固比的增大，咖啡種殼的水解率逐漸降低，水解率在液固比5 ∶1 時(shí)最高，為42.277%。液固比增高，稀硫酸與咖啡種殼接觸不充分，導(dǎo)致水解率降低。故選取液固比為5 ∶1 最有利于咖啡種殼水解。

圖2 液固比對(duì)水解率的影響

2.1.3 水解溫度對(duì)咖啡種殼酸水解糖化的影響

如圖3 所示，咖啡種殼的水解率隨著水解溫度的升高而緩慢上升，在120 ℃時(shí)得到最大值58.24%。隨著溫度的升高，化學(xué)反應(yīng)加速了纖維素的水解，當(dāng)繼續(xù)升溫到120 ℃以上時(shí)，可能發(fā)生脫水反應(yīng)，生產(chǎn)糠醛、羥甲基糠醛和酚類(lèi)化合物，導(dǎo)致水解率降低[8]。說(shuō)明溫度過(guò)低時(shí)，水解不夠完全，水解率低，但是溫度也不能過(guò)高。在此單因素實(shí)驗(yàn)中，120 ℃是最合適的水解溫度。

圖3 水解溫度對(duì)水解率的影響

2.1.4 水解時(shí)間對(duì)咖啡種殼酸水解糖化的影響

如圖4 所示，水解時(shí)間在90 min 時(shí)水解率最高，為29.821%。水解時(shí)間對(duì)酸水解糖化比較關(guān)鍵，充分的時(shí)間，有利于使水解液與咖啡種殼的纖維素充分接觸，使纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，有利用還原糖的產(chǎn)生。當(dāng)水解時(shí)間超過(guò)90 min 時(shí)，水解率下降，可能由于稀硫酸與咖啡種殼充分反應(yīng)后，使木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，或者使還原糖結(jié)構(gòu)破壞[9]。所以此單因素實(shí)驗(yàn)中，90 min 是最合適的水解時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

如表2 所示，各因素對(duì)水解率影響的主次順序?yàn)闀r(shí)間（D）＞液固比（B）＞硫酸濃度（A）＞溫度（C），咖啡種殼酸水解糖化最優(yōu)工藝條件為A2B3C3D2，即液固比8 ∶1、溫度130 ℃、時(shí)間90 min、硫酸濃度3.5%。

圖4 水解時(shí)間對(duì)水解率的影響

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由于水解溫度對(duì)咖啡種殼的水解率影響較小，以水解溫度為誤差所在列考慮硫酸濃度、液固比、水解溫度的顯著性，可以看出水解時(shí)間對(duì)咖啡種殼水解率影響顯著，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由方差分析可得理論咖啡種殼酸水解糖化最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，即液固比8 ∶1、水解溫度130 ℃、水解時(shí)間90 min、硫酸濃度3.5%的條件下，水解率為35.24%，明顯高于表2 中其他試驗(yàn)組，所以本試驗(yàn)采用此組數(shù)據(jù)為咖啡種殼酸水解糖化的最優(yōu)工藝條件。

3 結(jié)論

咖啡種殼酸水解糖化最優(yōu)工藝條件為：液固比8 ∶1、溫度130 ℃、水解時(shí)間90 min、硫酸濃度3.5%，實(shí)際測(cè)定水解率為35.24%。合適的酸水解糖化工藝條件對(duì)水解率的提高至關(guān)重要，為咖啡種殼的高值化利用提供了方向，為生物質(zhì)能源乙醇的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供相應(yīng)的工藝參數(shù)和理論依據(jù)，同時(shí)也為咖啡加工后廢棄物的綜合利用和深入研究奠定了基礎(chǔ)，避免了資源浪費(fèi)。