周明，王萍，朱炎，裘捷，丁春梅，王偉

（1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；2.歐萊雅研發(fā)與創(chuàng)新中心，上海 201206）

皮膚的保濕作用是皮膚屏障功效中一個(gè)重要的指標(biāo)。透明質(zhì)酸（Hyaluronan，HA）又稱玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的雙糖單位玻尿酸，分子能攜帶500 倍以上的水分，是當(dāng)今公認(rèn)的最佳保濕成分，被廣泛應(yīng)用于保養(yǎng)品和化妝品中[1-3]。最新的研究證實(shí)，HA 在成纖維細(xì)胞及表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞中均能產(chǎn)生，存在于大多數(shù)皮膚細(xì)胞的分解合成代謝動(dòng)態(tài)中[1-3]。在成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中，HA 在細(xì)胞胞外基質(zhì)與主要細(xì)胞表面的錨定受體CD44 蛋白相互作用，在控制細(xì)胞生理過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號直接或間接地通過CD44與細(xì)胞骨架、EGF（表皮細(xì)胞生長因子）和TGF（轉(zhuǎn)化生長因子）受體等進(jìn)行交互作用[4-5]。本研究旨在二維角質(zhì)細(xì)胞和三維EpiSkin 表皮模型上測試化妝品原料對CD44 蛋白表達(dá)的影響，比較兩個(gè)系統(tǒng)表達(dá)的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

人原代角質(zhì)形成細(xì)胞是從正常人包皮環(huán)切術(shù)的醫(yī)療廢棄樣品中分離獲?。籈piSkin 表皮模型由斯安膚諾（上海）有限公司生產(chǎn)。測試的化妝品原料及濃度如表1 所示。

1.2 試劑與儀器

4% 組織細(xì)胞固定液，Solarbio P1110；DAPI，Invitrogen D1306；24 孔細(xì)胞爬片，晶安生物；大鼠抗CD44 抗體，Merck 217594；驢抗大鼠IgG 熒光標(biāo)記二抗，Invitrogen A21208。

KS-18 超凈工作臺(tái)，ThermoFisher；240i 二氧化碳培養(yǎng)箱，HERAcell；DMI3000B 倒置相差顯微鏡，Leica；Ti-S 熒光顯微鏡，NIKON；Countess Ⅱ細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，美國Invitrogen；XP205/XS2002S 電子天平，METTLER TOLEDO；BCD-241WDBB 冷藏冰箱，海爾；MDF-U73V 超低溫冰箱，SANYO；CY50925-70液氮罐，Thermo-Fisher；SILVER 水浴鍋，LAUDA ECO；Sorvall ST16R 離心機(jī)，Thermo-Fisher。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 2D 人角質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

如圖1 所示，在48 h 的圖片視野中主要觀察到的是3t3 飼養(yǎng)層細(xì)胞。人角質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)6 d 后融合率在70%～80%左右時(shí)用胰酶消化收獲細(xì)胞。

圖1 角質(zhì)細(xì)胞在接種不同時(shí)間后的細(xì)胞形態(tài)

1.3.2 2D 人角質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及原料處理

人角質(zhì)細(xì)胞在含10% FBS（Gibco）的DMEM/F12（3 ∶1）（Gibco）培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d 后，接種至放置了細(xì)胞爬片（晶安生物）的24 孔板中。細(xì)胞樣品按處理分組，加入相應(yīng)原料濃度（表2）的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.3.3 3D EpiSkin 人表皮模型的培養(yǎng)及原料處理

人角質(zhì)細(xì)胞通過擴(kuò)增后接種于膠原基質(zhì)的插件上，液-液培養(yǎng)3 d 后，用分化培養(yǎng)基進(jìn)行4 d 的氣-液培養(yǎng)。在模型培養(yǎng)7 d 后，模型按處理分組，加入相應(yīng)原料濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。各分組如表3所示。

表1 測試的原料及濃度

表2 二維測試體系分組處理

表3 三維測試體系分組處理

1.3.4 人角質(zhì)細(xì)胞CD44 蛋白熒光染色

人角質(zhì)細(xì)胞樣品培養(yǎng)48 h 后用4%多聚甲醛固定，然后用5%的驢血清封閉，再加入抗CD44 蛋白的抗體（Abcam）4 ℃孵育過夜。第2 d 用AF488 標(biāo)記的二抗（Invitrogen）室溫孵育后，用DAPI（Dako）對細(xì)胞核染色，用抗熒光焠滅劑（Dako）封片。

1.3.5 EpiSkin 人表皮模型CD44 蛋白熒光染色

表皮模型樣品在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后收樣，進(jìn)行10 μm 冷凍切片（LEICA），用0.2%的BSA封閉1 h，用抗CD44 蛋白抗體（Abcam）室溫孵育1 h 后用AF488 標(biāo)記的二抗（Invitrogen）室溫孵育1 h，最后用DAPI（Dako）對細(xì)胞核染色，用抗熒光焠滅劑（Dako）封片。

1.3.6 圖像和數(shù)據(jù)處理

通過熒光顯微鏡對熒光染色切片樣品進(jìn)行觀察，每個(gè)樣品隨機(jī)選取5 個(gè)區(qū)域拍照。用ImageJ 軟件（1.48 V）對拍攝的圖片進(jìn)行定量分析統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理組的數(shù)據(jù)值（累積光密度IOD）與相應(yīng)對照組的IOD 進(jìn)行比較得出相對IOD 值，誤差條標(biāo)示每個(gè)處理組的標(biāo)準(zhǔn)方差，采用雙尾t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CD44 蛋白在人角質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)

如圖2 和圖3 所示，相比于對照組，ProVB5和HA 單獨(dú)處理組和聯(lián)合配伍組的二維細(xì)胞系統(tǒng)中CD44 蛋白表達(dá)都有顯著增加。

圖2 CD44 蛋白在人角質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)（熒光照片）

2.2 CD44 蛋白在EpiSkin 人表皮模型上的表達(dá)

如圖4 和圖5 所示，各處理組相比對照組，CD44 蛋白表達(dá)未見顯著增加，但觀察到RA 處理組相比DMSO 對照組模型厚度有顯著增厚。

圖3 CD44 蛋白在人角質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)

圖4 CD44 蛋白在EpiSkin 人表皮模型上的表達(dá)（熒光照片）

圖5 CD44 蛋白在EpiSkin 人表皮模型上的表達(dá)及EpiSkin 模型細(xì)胞層厚度

HA 是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在皮膚組織尤其是表皮中含量豐富。CD44 蛋白是一個(gè)普遍存在、數(shù)量豐富、功能重要的細(xì)胞表面受體家族，同時(shí)也是HA 的錨定結(jié)合受體[8-9]。從圖2 和圖5a 可以看出，CD44 蛋白普遍表達(dá)于角質(zhì)細(xì)胞表面和EpiSkin 模型基底層、棘層，角質(zhì)層存在一定非特異性吸附作用，使得熒光信息也出現(xiàn)在角質(zhì)層。

有報(bào)道在離體人皮膚和小鼠上進(jìn)行了HA 對CD44 表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)[10-11]，但在EpiSkin 模型上CD44 蛋白的表達(dá)情況未見有相關(guān)研究和報(bào)道。本研究從皮膚模型的角度考察了在不同化妝品原料的共培養(yǎng)下，CD44 蛋白在EpiSkin 模型上的表達(dá)情況。在角質(zhì)形成細(xì)胞的二維模型上，可以觀察到單獨(dú)的ProVB5 和HA 組或者兩者的配伍組對CD44 蛋白的表達(dá)都有顯著的增強(qiáng)作用（圖3），但這種增強(qiáng)效果在EpiSkin 模型上并未觀察到（圖5a）。與三維皮膚模型中的角質(zhì)形成細(xì)胞相比，二維培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞存在以下2 點(diǎn)區(qū)別：（1）形態(tài)上不具備角質(zhì)形成細(xì)胞分化后形成的基底層、棘層顆粒層角質(zhì)層等分層結(jié)構(gòu)；（2）不具備角質(zhì)形成細(xì)胞分化后胞內(nèi)的生化代謝酶體系。因此，CD44 蛋白在二維和三維體系中的表達(dá)存在很大的差異，這也是三維皮膚模型用來研究人體皮膚具有的優(yōu)勢之一[12]。

在EpiSkin 模型上雖然沒有觀察到CD44 表達(dá)的顯著變化，但發(fā)現(xiàn)RA 處理組對皮膚模型在厚度的影響上有顯著差異（圖5b）。有相關(guān)研究表明，RA 對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化具有很強(qiáng)的作用[13]。從本研究結(jié)果看，RA 對皮膚模型中的角質(zhì)形成細(xì)胞基底層具有強(qiáng)烈的增殖作用，造成皮膚模型分化不全（缺少顆粒層）。該現(xiàn)象提醒今后的研究需要注意RA 極強(qiáng)的增殖作用造成分化不全的特點(diǎn)。RA 對表皮模型的顯著增厚作用源于RA 對細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖分化作用，該作用可以使其在活性化妝品原料對皮膚的增殖分化研究中作為一種參照。

基于EpiSkin 表皮模型技術(shù)開發(fā)的中國人角質(zhì)形成細(xì)胞表皮重建模型已于2015 年起商用。該表皮模型形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)、分化標(biāo)記、屏障功能以及批次的穩(wěn)定性和重復(fù)性都通過了驗(yàn)證。EpiSkin 表皮模型是一種成熟的商業(yè)化產(chǎn)品，用于模擬人體表皮的科學(xué)研究和對化妝品原材料和成品的安全性評估都是強(qiáng)有力的工具[6-7]。本研究首次選用EpiSkin 表皮模型來測試化妝品原材料對CD44 蛋白表達(dá)的影響，這也是對EpiSkin 表皮模型應(yīng)用領(lǐng)域的一次探索性研究。

3 結(jié)論

與二維模型相比，三維表皮模型用于人體皮膚研究更具有優(yōu)勢。視黃酸對表皮模型。后續(xù)的研究可以采用其他皮膚模型再次驗(yàn)證，可以作為開發(fā)皮膚模型評估增殖愈合相關(guān)的功效的研究方向。

在人角質(zhì)細(xì)胞測試中，ProVB5、HA 單獨(dú)處理組和聯(lián)合配伍組的CD44 蛋白表達(dá)均有顯著增加，但這種現(xiàn)象未在表皮模型中觀察到，因此CD44 蛋白在二維和三維體系中的表達(dá)存在差異；RA 對表皮模型的顯著增厚作用源于RA 對細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖分化作用，該作用可以使其在活性化妝品原料對皮膚的增殖分化研究中作為一種參照。