劉慧春，張加強(qiáng)，馬廣瑩，周江華，許雯婷，朱開(kāi)元

（浙江省園林植物與花卉研究所，杭州 311251）

當(dāng)植物遇到諸如澇害、干旱、低溫等非生物脅迫時(shí)，會(huì)誘發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生一系列適應(yīng)性反應(yīng)[1-2]。為了適應(yīng)或忍耐這些非生物脅迫，保護(hù)植物自身的細(xì)胞代謝，一些相關(guān)聯(lián)的功能蛋白會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)[3]。脫水素蛋白（dehydrin,DHN）就是其中一種，它屬于發(fā)育晚期豐富蛋白（late embryo-genesis abundant protein,LEA）第2家族成員，最早在受水分脅迫的水稻中被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)該蛋白廣泛存在于植物細(xì)胞中[4-5]。許多研究表明，在低溫、高溫、高鹽、干旱等非生物脅迫下，植物脫水素蛋白基因的表達(dá)和積累與植物適應(yīng)逆境脅迫的能力密切相關(guān)[6]。因此，DHN基因也引起了人們較多的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，脫水素具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在植物遭遇非生物脅迫時(shí)，該蛋白對(duì)維持植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的保護(hù)作用[7]。它的具體功能體現(xiàn)在清除細(xì)胞內(nèi)的自由基、保護(hù)細(xì)胞的酶活性、穩(wěn)定細(xì)胞膜、清除活性氧等[8]。國(guó)內(nèi)外科研人員已在多個(gè)物種上開(kāi)展了有關(guān)DHN 的研究，如小麥的脫水素基因TaDHN-1參與了小麥對(duì)干旱、高鹽和低溫等逆境脅迫的調(diào)節(jié)過(guò)程[9]；紅樹(shù)的脫水素基因AoDHN1受鹽脅迫、干旱脅迫的誘導(dǎo)而表達(dá)[10]。不僅如此，通過(guò)過(guò)表達(dá)脫水素基因，還能提高植物抵抗非生物脅迫的能力，如過(guò)表達(dá)仙人掌脫水素基因OpsDHN1能夠增強(qiáng)擬南芥的抗凍性[11]；沙冬青的AnDHN基因能改善擬南芥的抗鹽性和抗旱性[12]；大麥的脫水素基因能有效改善擬南芥對(duì)甘露醇的滲透脅迫抗性等[13]。

牡丹（Paeonia suffruticosa）是我國(guó)的國(guó)花，肉質(zhì)根，特別不耐水濕，從而限制了牡丹在江南地區(qū)的種植面積和品質(zhì)。因此，如何提高牡丹的耐澇性以及培育出耐澇品種顯得尤為重要。挖掘牡丹耐澇的關(guān)鍵基因，是開(kāi)展牡丹分子育種的基礎(chǔ)工作。迄今為止，尚未見(jiàn)牡丹脫水素基因克隆及其響應(yīng)澇害脅迫方面的相關(guān)報(bào)道。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究從牡丹葉片中獲得了響應(yīng)澇害脅迫的DHN1基因片段?；诖?，采用cDNA 末端快速擴(kuò)增（rapidamplification of cDNA ends, RACE）技術(shù)結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)克隆獲取該基因的全長(zhǎng)cDNA 序列，對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行分析，并通過(guò)過(guò)表達(dá)擬南芥探討牡丹DHN1基因的功能及其調(diào)控耐澇性的機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)展牡丹耐澇分子育種做好準(zhǔn)備工作。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型擬南芥由浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院提供，牡丹葉片采自浙江省園林植物與花卉研究所牡丹資源圃。

1.2 研究方法

1.2.1 總RNA 提取

采用TR02-150 植物總RNA 純化試劑盒（中國(guó)臺(tái)灣GeneMark 生物科技有限公司）提取牡丹葉片的總RNA，并以獲得的RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄酶（Code No.2641Q）（日本TaKaRa公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而獲得cDNA。

1.2.2PsDHN1基因的克隆

在前期獲得的牡丹DHN1基因片段的基礎(chǔ)上，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier 6.0 設(shè)計(jì)5′RACE 引物5′RP-F/5′RP-R和3′RACE引物3′RP-F/3′RP-R（表1），并使用SMARTer?RACE 5′/3′試劑盒（美國(guó)Clontech公司），參照其說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增獲得PsDHN1基因的5′和3′末端序列。

將上述獲得的5′和3′末端序列與前期獲得的PsDHN1中間序列拼接起來(lái)并對(duì)其測(cè)序，最終獲得牡丹PsDHN1基因的全長(zhǎng)cDNA序列。以該序列為參考，分別設(shè)計(jì)上、下游引物GF 和GR（表1），以1.2.1 節(jié)獲得的cDNA 為模板，獲得牡丹PsDHN1的全長(zhǎng)cDNA 序列，PCR 擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.3PsDHN1基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）上的開(kāi)放閱讀框（open reading frame,ORF）識(shí)別工具，獲取PsDHN1基因的開(kāi)放閱讀框；利用在線(xiàn)工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)該基因氨基酸序列的理化指標(biāo)進(jìn)行分析；采用NetPhos 3.1 在線(xiàn)工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對(duì)該基因編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用NCBI網(wǎng)站中的Blastp程序?qū)υ摶虻耐葱蛄羞M(jìn)行搜索，并對(duì)搜索到的同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)；采用軟件CLC Genomics Workbench 11.0.1 進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和聚類(lèi)分析；采用在線(xiàn)軟件I-TASSER（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ITASSER/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.4PsDHN1基因的亞細(xì)胞定位

將獲得的PsDHN1編碼序列插入到35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pCAMBIA1305-GFP載體中，構(gòu)建重組載體35S::GFP-PsDHN1。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法分別將重組載體和空載體35S::GFP轉(zhuǎn)化到本氏煙草（Nicotiana benthamiana）葉片的表皮細(xì)胞中，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察2 種載體的熒光顯示結(jié)果。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及培養(yǎng)

將克隆獲得的牡丹PsDHN1基因開(kāi)放閱讀框與表達(dá)載體pSY06 通過(guò)同源重組系統(tǒng)進(jìn)行融合。將基因構(gòu)建物PsDHN1-pSY06 連接到UBQ10 啟動(dòng)子上，采用蘸花法將其轉(zhuǎn)化入擬南芥，并在草銨膦上篩選轉(zhuǎn)化子。根據(jù)一級(jí)轉(zhuǎn)化子代中抗病或感病植株對(duì)草銨膦的分離比例，篩選出含有單一插入（PsDHN1全長(zhǎng)編碼區(qū)）的品系，從而獲得純合株系，并進(jìn)一步獲得純合表達(dá)的轉(zhuǎn)PsDHN1基因的擬南芥T2代株系。采用擬南芥播種基質(zhì)[m（蛭石）∶m（珍珠巖）=2∶1]，分別播種T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子和試驗(yàn)材料野生型擬南芥種子于其上，在擬南芥生長(zhǎng)室[晝夜溫22 ℃/18 ℃，濕度75%，光照/黑暗12 h/12 h，光照強(qiáng)度400μmol/（m2·s）]培養(yǎng)10 d 后進(jìn)行定植，轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥各定植50株。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥PsDHN1基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以1.2.2節(jié)獲得的PsDHN1基因序列為參考，內(nèi)參基因選擇18S rRNA，采用在線(xiàn)工具Primer-Blast（http://ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。18S rRNA的引物序列如下：GTGA CGGGTGACAGAGAATTAG/CCGTGTCAGGATT GGGTATTT。PsDHN1的引物序列如下：CGGTGC GATGGTGTCATATT/CAAGGTGGGAGAAGGAAG AAAG。使用熒光定量PCR 儀（Mastercycler?ep realplex 4）（德國(guó)Eppendorf 公司）進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火10 s，38 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，65～95 ℃每增加0.5 ℃讀取熒光1次，繪制熔解曲線(xiàn)。基因表達(dá)水平采用2－△△CT法進(jìn)行計(jì)算，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 澇害處理

從培養(yǎng)40 d 后的擬南芥T2代轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株中，各選出30株大小一致的植株備用。將這60 株擬南芥連盆一起浸沒(méi)在裝有水的方形泡沫盒中，以淹沒(méi)盆土表面1.5 cm 深度為宜。在0～5 d期間，每天上午選擇同一時(shí)間進(jìn)行取樣，取樣部位為蓮座葉的第3 片葉，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，經(jīng)液氮速凍后放入－80 ℃冰箱保存，備用。其中20株植株（轉(zhuǎn)基因和野生型各10株）在澇害處理結(jié)束后，再恢復(fù)生長(zhǎng)1周，觀察其恢復(fù)情況。

1.2.8 擬南芥酶活性測(cè)定

將樣品從－80 ℃冰箱中取出，按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（上海市江萊生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行粗酶液的提取和相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定，具體包括蔗糖合成酶（sucrose synthase, SS）、丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase, PDC）、α-淀粉酶（αamylase, RAMY）活性和可溶性蛋白（soluble protein,PRO）含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 PsDHN1 基因的克隆結(jié)果

根據(jù)前期獲得的牡丹DHN1基因片段，采用RACE 引物，以牡丹葉片的cDNA 為模板，進(jìn)行RACE-PCR 擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度為864 bp 的牡丹PsDHN1全長(zhǎng)序列。該序列包含1 個(gè)長(zhǎng)471 bp 的開(kāi)放閱讀框、104 bp的5′非編碼區(qū)和289 bp的3′非編碼區(qū)；含1個(gè)信號(hào)肽，位于多聚A（poly A）尾的815～864 bp 處。分析可知，PsDHN1編碼156 個(gè)氨基酸；結(jié)合在線(xiàn)工具ExPASy（http://www.expasy.org/）分析其結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，PsDHN1全長(zhǎng)序列含有2 個(gè)Y 片段、1個(gè)S片段和2個(gè)K片段（圖1）。

2.2 PsDHN1 編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

對(duì)PsDHN1基因編碼的蛋白進(jìn)行氨基酸含量和理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明：該蛋白的分子質(zhì)量為16.39 kDa，理論等電點(diǎn)為8.87，其氨基酸構(gòu)成的數(shù)量及占比如表2所示。該蛋白帶負(fù)電氨基酸殘基數(shù)為14，帶正電氨基酸殘基數(shù)為16；脂肪族指數(shù)為34 042，親水性指數(shù)為－1.274，推測(cè)PsDHN1 蛋白為親水性蛋白；不穩(wěn)定性指數(shù)為44.05，推測(cè)其為不穩(wěn)定性蛋白。

2.3 PsDHN1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)對(duì)PsDHN1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，可知該蛋白含有3個(gè)α-螺旋和1個(gè)β-折疊。其氨基酸序列中的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)如圖2 所示。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，被預(yù)測(cè)的PsDHN1 蛋白質(zhì)中含有8個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)絡(luò)氨酸磷酸化位點(diǎn)（表3）。

圖1 PsDHN1基因全長(zhǎng)cDNA序列及其推測(cè)的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域Fig.1 Full length sequence of cDNA and deduced amino acid sequences and protein domains of PsDHN1 gene

表2 PsDHN1蛋白的氨基酸組分Table 2 Amino acid components of PsDHN1 protein

圖2 PsDHN1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Predicted secondary structure of PsDHN1 protein

2.4 PsDHN1 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用I-TASSER 軟件，以315a 為模板，對(duì)牡丹PsDHN1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。從圖3中可知，藍(lán)色為預(yù)測(cè)蛋白的氮端，紅色為預(yù)測(cè)蛋白的碳端。預(yù)測(cè)的PsDHN1蛋白結(jié)構(gòu)的置信度（C）為－3.76，表明該蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)與模板3l5a 的同類(lèi)結(jié)構(gòu)相似度非常高；進(jìn)一步分析可知，PsDHN1目標(biāo)蛋白和模板蛋白315a的結(jié)構(gòu)相似度為0.31±0.10。

表3 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Table 3 Predicted results of phosphorylation sites

圖3 PsDHN1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted tertiary structure of PsDHN1 protein

2.5 PsDHN1 蛋白的多序列比對(duì)及同源性分析

通過(guò)對(duì)牡丹PsDHN1基因與胡桃、苦瓜、麻風(fēng)樹(shù)等9個(gè)物種DHN1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PsDHN1基因編碼的蛋白具有高度保守性，含有典型的保守結(jié)構(gòu)域Y 片段（對(duì)應(yīng)于PsDHN1的第11—18、21—28個(gè)氨基酸）、S片段（對(duì)應(yīng)于PsDHN1的第68—82個(gè)氨基酸）和K片段（對(duì)應(yīng)于PsDHN1 的第88—102、140—154 個(gè)氨基酸）（圖4），推測(cè)它們可能是牡丹脫水素蛋白的重要功能區(qū)。

由Blastp 比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牡丹PsDHN1 蛋白與其他9 個(gè)物種存在著一定的相似性。其中，牡丹PsDHN1 蛋白與苦瓜（Momordica charantia）DHN1蛋白的相似度為58%，與麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcas）和胡桃（Juglans regia）的相似度分別為54% 和53%。由此得出，PsDHN1 蛋白與這3 個(gè)物種的DHN1 蛋白同源性較高。將這10 個(gè)物種的DHN1蛋白進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牡丹PsDHN1蛋白與胡桃（J. regia）、平榛（Corylus heterophylla）的聚為一類(lèi)（圖5）。

2.6 PsDHN1 的亞細(xì)胞定位分析

為了明確PsDHN1基因在細(xì)胞中的具體表達(dá)部位，對(duì)其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析。通過(guò)構(gòu)建35S::GFP-PsDHN1融合表達(dá)載體，進(jìn)而通過(guò)根癌農(nóng)桿菌將其和空載體35S::GFP分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到本氏煙草葉片表皮細(xì)胞中。最后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：不含目的基因的空載體在轉(zhuǎn)化的煙草表皮細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中都有表達(dá)；而含有目的基因的35S::GFP-PsDHN1融合載體主要在煙草表皮細(xì)胞核和細(xì)胞膜中表達(dá)（圖6）。由此，我們推測(cè)牡丹脫水素基因PsDHN1主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上。

2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐澇性分析

2.7.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥PsDHN1基因的定量表達(dá)分析

為了驗(yàn)證PsDHN1是否成功地轉(zhuǎn)入擬南芥，我們對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了該基因的定量表達(dá)分析（圖7）。從T3代純合的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中隨機(jī)選擇3個(gè)株系（P1、P2 和P3），以野生型擬南芥（WT）為對(duì)照，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。結(jié)果顯示：在3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中，PsDHN1基因的表達(dá)量是野生型擬南芥的12～50 倍，其中株系P2 的表達(dá)量最高（為WT的50倍），其次是株系P3（14倍）和P1（12倍）。由此說(shuō)明，PsDHN1基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥中。

圖4 牡丹PsDHN1蛋白的多序列比對(duì)Fig.4 Multiple protein sequence alignment of PsDHN1 in P.suffruticosa

2.7.2 耐澇性表型分析

圖5 PsDHN1蛋白與其他物種DHN1蛋白的聚類(lèi)分析Fig.5 Clustering analysis of PsDHN1 protein and DHN1 proteins of other species

圖6 PsDHN1在本氏煙草葉片中的亞細(xì)胞定位Fig.6 Subcellular localization of PsDHN1 in the leaves of N.benthamiana

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥PsDHN1基因的實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析Fig.7 Real-time PCR expression analysis of PsDHN1 gene in transgenic Arabidopsis

對(duì)轉(zhuǎn)PsDHN1基因的擬南芥植株及野生型植株進(jìn)行澇害處理5 d后，觀察其表型變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WT 相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐澇性要強(qiáng)于野生型植株。澇害處理5 d 后，野生型植株蓮座葉的心部開(kāi)始出現(xiàn)爛葉現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因植株除生長(zhǎng)緩慢外，沒(méi)有出現(xiàn)其他受害癥狀（圖8A～B）。為進(jìn)一步觀察澇害處理后的植株恢復(fù)情況，將其從水槽中取出，正常培養(yǎng)7 d后觀察其生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥接近50%的植株葉片枯黃、萎蔫，無(wú)法恢復(fù)正常生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)基因擬南芥100%的植株都能恢復(fù)至正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并開(kāi)始抽薹、開(kāi)花（圖8B～D）。綜上所述，牡丹PsDHN1基因轉(zhuǎn)化擬南芥后，明顯提高了擬南芥的耐澇性。

2.7.3 澇害相關(guān)的生理指標(biāo)測(cè)定

圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥澇害處理的表型變化Fig.8 Phenotypic changes of transgenic Arabidopsis plants under waterlogging stress

如圖9A 所示：轉(zhuǎn)PsDHN1基因的擬南芥植株在澇害處理的0～5 d內(nèi)，其體內(nèi)的蔗糖合成酶（SS）活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在第4 天時(shí)蔗糖合成酶活性達(dá)到最大值（592.93 U/g）；第0 天時(shí)轉(zhuǎn)基因植株的SS 活性最低（446.11 U/g）。野生型擬南芥植株（WT）SS 活性的變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)基因植株類(lèi)似，但在澇害脅迫處理前后，其SS 活性均低于轉(zhuǎn)基因植株；澇害處理4 d 時(shí)，其SS 活性達(dá)到最大值。澇害處理3 d 時(shí)，WT 與轉(zhuǎn)基因植株之間的SS 活性差值最大，達(dá)93.94 U/g。如圖9B所示：轉(zhuǎn)基因擬南芥在澇害處理的0～4 d 內(nèi)，其體內(nèi)丙酮酸脫羧酶（PDC）活性呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在第0 天時(shí)其PDC 活性最低（0.072 9 U/g），到第4 天達(dá)到最高（0.114 9 U/g）。野生型擬南芥植株的PDC 活性變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)基因植株相似，在澇害脅迫處理前，其PDC活性高于轉(zhuǎn)基因植株，但澇害處理后兩者的差距逐漸縮小，到第2 天時(shí)顯著低于轉(zhuǎn)基因植株。如圖9C 所示：轉(zhuǎn)基因擬南芥植株體內(nèi)的α-淀粉酶（RAMY）活性在澇害處理的0～3 d 內(nèi)呈逐漸下降的趨勢(shì)，第0 天時(shí)其RAMY 活性最高（0.36 U/g），到第3 天時(shí)活性降到最低（0.25 U/g）。野生型擬南芥植株的RAMY 活性變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)基因植株相似。澇害處理后，除第1 天外，轉(zhuǎn)基因植株的RAMY 活性均高于野生型。如圖9D所示：澇害處理期間，轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥植株體內(nèi)的可溶性蛋白含量均表現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢(shì)。在澇害處理的0～2 d內(nèi)，兩者的PRO含量非常接近且均呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)；到第3 天，兩者呈顯著性差異，轉(zhuǎn)基因植株中PRO 含量是野生型植株的1.4 倍。澇害處理后期（3～5 d），轉(zhuǎn)基因植株的PRO 含量均明顯高于野生型植株。

綜上所述，轉(zhuǎn)牡丹PsDHN1基因的擬南芥和野生型擬南芥在經(jīng)過(guò)澇害處理后，其植株體內(nèi)與澇害脅迫相關(guān)的酶如SS、PDC、RAMY 的活性和PRO 的含量均發(fā)生了較大的變化。在擬南芥植株上過(guò)表達(dá)牡丹PsDHN1基因，其SS和PDC活性得到明顯提高。另外，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)與澇害脅迫相關(guān)的酶活性或含量總體上均高于野生型植株。

圖9 澇害脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的生理指標(biāo)測(cè)定Fig.9 Physiological index measurement of transgenic Arabidopsis under waterlogging stress

3 討論

植物在面臨逆境脅迫時(shí)，其體內(nèi)會(huì)合成一系列的逆境響應(yīng)蛋白，以抵抗和適應(yīng)環(huán)境脅迫的傷害[3]。脫水素蛋白是植物在非生物脅迫過(guò)程中被誘導(dǎo)表達(dá)的重要功能蛋白，在植物耐受逆境過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[14]。脫水素蛋白在模式植物擬南芥，農(nóng)作物小麥、水稻、棉花、番茄，觀賞植物仙人掌、杜鵑等多種高等植物上均有被發(fā)現(xiàn)[11,15-19]。該蛋白是一類(lèi)重要的LEA蛋白，含有典型的Y片段和K片段保守結(jié)構(gòu)域[6]。本研究從牡丹葉片中克隆獲得了1 個(gè)脫水素基因PsDHN1，該基因編碼的蛋白含有2個(gè)Y片段、1個(gè)S片段和2個(gè)K片段，是一個(gè)Y2SK2型脫水素，符合LEA 蛋白的典型特征，而且可能也是其發(fā)揮抗逆境脅迫作用的關(guān)鍵部分。前人的研究發(fā)現(xiàn)，脫水素中位于蛋白序列C 端的富含賴(lài)氨酸的K 片段，可以形成α-螺旋，該螺旋與其他蛋白的生物膜表面進(jìn)行互作，從而在細(xì)胞脫水保護(hù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，以保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。蛋白結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的磷酸化現(xiàn)象，在脫水中也發(fā)揮著重要的作用[20-22]。本研究中對(duì)牡丹脫水素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PsDHN1蛋白包含3個(gè)α-螺旋和1個(gè)β-折疊，8個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)絡(luò)氨酸磷酸化位點(diǎn)。由此，我們推測(cè)PsDHN1蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)和磷酸化位點(diǎn)在牡丹的澇害脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

大量研究表明，脫水素基因在干旱、高/低溫、高鹽堿等逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程中扮演著重要的角色[7,23-25]。通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段將其轉(zhuǎn)入植物，可以明顯提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性。例如，在擬南芥中超量表達(dá)小麥脫水素基因DHN5，改善了擬南芥滲透脅迫抗性和抗鹽性[26]；過(guò)表達(dá)杜鵑的脫水素基因RcDHN5提高了擬南芥的抗低溫能力[19]；在煙草中過(guò)表達(dá)SbDHN1基因提高了植株對(duì)逆境脅迫的耐受能力等[27]。在諸多研究中，涉及最多的是脫水素基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng)，而對(duì)于澇害脅迫，僅見(jiàn)報(bào)道的有芍藥PIDHN1基因。該基因在響應(yīng)低溫、高溫、澇害和脫落酸（ABA）等脅迫過(guò)程中，表現(xiàn)出不同的敏感性，其中對(duì)澇害的敏感程度最高，其次是高溫、ABA 和低溫[28]。然而，同樣的基因在不同的物種上，其表現(xiàn)模式是否相同有待驗(yàn)證。為此，我們從牡丹中獲得了脫水素基因PsDHN1，并對(duì)其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析。與芍藥PIDHN1定位結(jié)果相似：芍藥PIDHN1定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上，而本研究獲得的牡丹脫水素蛋白PsDHN1也主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上。為進(jìn)一步驗(yàn)證該基因的功能，本研究將其轉(zhuǎn)化到擬南芥中，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行澇害處理。通過(guò)分析表型變化發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)PsDHN1基因的擬南芥在經(jīng)歷持續(xù)5 d的澇害脅迫處理后，野生型植株受澇癥狀比轉(zhuǎn)基因植株明顯；再經(jīng)過(guò)7 d的恢復(fù)生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)野生型植株比轉(zhuǎn)基因植株恢復(fù)得差。所以，我們認(rèn)為牡丹PsDHN1基因轉(zhuǎn)入擬南芥后可以提高其耐澇性。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，植物在遭受澇害脅迫時(shí)，其根系處于低氧或無(wú)氧狀態(tài)，會(huì)導(dǎo)致地上部分的碳水化合物大量消耗從而引起代謝紊亂。植物為了適應(yīng)逆境、減輕自身受到的傷害，會(huì)啟動(dòng)與代謝相關(guān)的一些酶如SS、ADH、PDC 和RAMY 等來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)[29]。因此，本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥中的這4 個(gè)主要酶活性或含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PsDHN1基因的擬南芥植株在澇害脅迫條件下，其體內(nèi)的SS 和PDC 活性得到明顯提高；與野生型植株相比，SS、PDC、RAMY 活性及PRO 含量都表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因植株總體上高于野生型植株的現(xiàn)象，這與我們前期對(duì)牡丹響應(yīng)澇害方面的研究結(jié)果存在一定的相似性[30]。由此說(shuō)明，在擬南芥上過(guò)表達(dá)PsDHN1基因，促進(jìn)了擬南芥體內(nèi)與糖代謝相關(guān)酶發(fā)揮作用，減輕了植株的受澇程度。該研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了牡丹脫水素基因PsDHN1可以提高植物的耐澇性，與前人報(bào)道的芍藥脫水素PIDHN1的基因功能結(jié)果一致，推測(cè)其原因：一方面可能與該基因本身的結(jié)構(gòu)、特性和功能有關(guān)，另一方面可能與牡丹和芍藥為同科同屬植物，親緣關(guān)系非常近有關(guān)。當(dāng)然，植物耐澇方面的功能基因很多，往往不是某一個(gè)基因在發(fā)揮作用，我們前期也挖掘了牡丹其他耐澇基因如PsGRP[30]。如果將這兩者都轉(zhuǎn)入擬南芥，是否會(huì)發(fā)揮更大的作用，以及PsDHN1基因在其他非生物脅迫下作用如何，都還有待后續(xù)開(kāi)展進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究采用RACE 技術(shù)從牡丹葉片中克隆獲得了PsDHN1基因，該基因的cDNA 序列全長(zhǎng)為864 bp，編碼156 個(gè)氨基酸，屬于典型的Y2SK2型脫水素，與胡桃的親緣關(guān)系最近。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，PsDHN1主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上。將該基因采用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥并進(jìn)行耐澇性分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PsDHN1基因的擬南芥植株的耐澇能力及恢復(fù)生長(zhǎng)的情況均優(yōu)于野生型植株，且澇害相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化也表明轉(zhuǎn)基因擬南芥耐澇能力高于野生型植株。該研究結(jié)果為牡丹耐澇基因的挖掘和進(jìn)一步研究牡丹耐澇的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為今后牡丹耐澇分子育種奠定了理論基礎(chǔ)。