朱樂，趙鑫澤，蔣立希

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院作物科學(xué)研究所/浙江省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

鉀（K）是植物內(nèi)一種重要的大量營養(yǎng)元素，占植物干物質(zhì)量的10%。鉀參與多種生化過程，包括蛋白質(zhì)合成、碳水化合物代謝和酶激活，以及許多生理過程，如氣孔調(diào)節(jié)和光合作用[1]。此外，鉀還可以增強(qiáng)作物對(duì)各種生物和非生物脅迫的抵抗力[2-3]。

植物對(duì)K＋的需求量很大而植物所處的環(huán)境又非常復(fù)雜，使得K＋轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)十分龐大，以至于植物從土壤中吸收的K＋可以通過不同的組織進(jìn)行再分配[4-5]。幾乎在所有的植物組織中，K＋轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)都是一個(gè)大的基因家族，編碼多種功能的蛋白質(zhì)，K＋轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族基因通常被分為4 大家族：HAK/KUP/KT、Trk/HKT、KEA和CHX家族。通過與細(xì)菌KUP和真菌HAKs 的序列進(jìn)行相似性比較，在擬南芥中鑒定出第1 個(gè)植物HAK/KUP/KT基因[6-7]。目前，HAK/KUP/KT家族數(shù)目龐大，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)起著重要作用。植物根系對(duì)鉀的吸收及其在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)是由許多K＋通道和轉(zhuǎn)運(yùn)子共同完成的[8-9]。K＋通道在外部高K＋濃度（＞0.5 mmol/L）下起作用，被認(rèn)為是低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；K＋轉(zhuǎn)運(yùn)體在外部低K＋濃度（＜0.2 mmol/L）下也可以發(fā)揮作用，屬于高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；但是，隨著K＋通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)目的增加，這2 類系統(tǒng)之間的分界線變得越來越模糊。

植物中存在多種HAK/KUP/KT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們?cè)贙的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)以及植物生長(zhǎng)發(fā)育、耐鹽性和滲透勢(shì)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不同的作用[10]。在擬南芥中，K＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtHAK5 和K＋通道蛋白AtAKT1 主要在根細(xì)胞中表達(dá)，促進(jìn)根細(xì)胞吸收外界環(huán)境中的K＋[11]。在正常K＋濃度條件下，在擬南芥根系中可檢測(cè)到AtHAK5轉(zhuǎn)錄本，而在芽中檢測(cè)不到；但在K＋缺乏的情況下，AtHAK5轉(zhuǎn)錄本在根系中的表達(dá)水平升高，而且在芽中也能檢測(cè)到AtHAK5轉(zhuǎn)錄本[12]。在水稻中，AtHAK5和AtAKT1的功能是由其同源基因OsAKT5和OsHAK1實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，水稻木質(zhì)部汁液中的K＋濃度以及OsHAK1突變體的K＋凈輸出率明顯低于野生型植物，特別是低K＋處理（0.1 mmol/L）的植株[13]。K＋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsHAK5 可提高K＋吸收親和力，在K＋濃度高于OsHAK1 蛋白濃度的情況下，OsHAK5基因在根部維管組織的木質(zhì)部薄壁組織和韌皮部中強(qiáng)烈表達(dá)，在缺K條件下尤為明顯，表明OsHAK5可能參與了根與芽之間的K 分配[14]。OsHAK21 具有K＋轉(zhuǎn)運(yùn)活性，但不直接參與K＋吸收。OsHAK21主要在中柱的根維管系統(tǒng)中表達(dá)，可能在根與芽的長(zhǎng)距離K＋分配中起作用[15]。

植物體內(nèi)K＋/Na＋比值的增大可增強(qiáng)其耐鹽性。OsHAK5的過表達(dá)增大了植株的K＋/Na＋比值，從而提高了植株的耐鹽性。相反，OsHAK5基因敲除突變體的K＋/Na＋比值降低，結(jié)果轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的敏感性增加[14]。OsHAK21在鹽脅迫反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用。在高鹽脅迫條件下，OsHAK21的表達(dá)量顯著增加，特別是在鹽脅迫4 h后，OsHAK21在根中的表達(dá)水平增加了600倍。在高鹽脅迫下，OsHAK21突變體在地上部和根部積累的K＋量均低于野生型（對(duì)照）。此外，HAK/KUP/KT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也在抗旱性中發(fā)揮作用。OsHAK1在水稻營養(yǎng)期和生殖期的過表達(dá)均增強(qiáng)了水稻的抗旱性，與對(duì)照相比，OsHAK1過表達(dá)幼苗的脂質(zhì)過氧化水平降低，脯氨酸積累量增加，抗氧化酶活性提高[15]。在干旱條件下，OsHAK1過表達(dá)植株的產(chǎn)量比野生型植株高出35%[16]。

上述研究表明，HAK/KUP/KT 家族成員對(duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育具有潛在價(jià)值，可以提高作物對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受力。同時(shí)，隨著我國缺K土壤面積日益擴(kuò)大，科學(xué)合理地施用K肥是提高K肥利用效率的有效措施[17-18]，而篩選K 高效基因型作物品種是緩解K肥需求壓力的另一有效途徑。近年來，越來越多的植物HAK/KUP/KT 家族被研究，如梨[19]、甘蔗[20]、辣椒[21]、小麥[22]、大豆[23]和水稻[24]等。油菜是世界上最重要的油料作物之一，其中甘藍(lán)型冬油菜生育期長(zhǎng)，對(duì)K 素需求量大，但是目前關(guān)于甘藍(lán)型油菜（Brassica napusL.）HAK/KUP/KT基因家族系統(tǒng)的鑒定和分析研究未見報(bào)道。

本研究利用已經(jīng)發(fā)布的甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)，對(duì)油菜中HAK/KUP/KT類K轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，并對(duì)HAK/KUP/KT 家族成員的基因特征、系統(tǒng)發(fā)育樹、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、染色體位置和順式作用元件等進(jìn)行了分析，為深入了解HAK/KUP/KT基因家族的功能及培育K高效油菜品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 家族成員的鑒定與分析

甘藍(lán)型油菜的蛋白質(zhì)序列來源于已公布的數(shù)據(jù)庫（http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/）；分別從擬南芥的數(shù)據(jù)庫[The Arabidopsis Information Resource(TAIR),https://www.arabidopsis.org/]和水稻的數(shù)據(jù)庫（Rice Genome Annotation Project, http://rice.plantbiology.msu.edu）中下載擬南芥和水稻的蛋白質(zhì)序列；從Phytozome 數(shù)據(jù)庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中下載甘藍(lán)、白菜和大麥的蛋白質(zhì)序列；隨后，以其他物種的HAK/KUP/KT蛋白質(zhì)序列為查詢序列，與甘藍(lán)型油菜的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行Blastp比對(duì)，篩選閾值小于10－10、相似性大于50%的蛋白質(zhì)序列；再在Pfam 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）中下載HAK/KUP/KT基因家族的隱馬爾可夫模型（PF02705）。利用在線分析軟件HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）分別對(duì)蛋白質(zhì)序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定，最終確定甘藍(lán)型油菜特異的HAK/KUP/KT家族成員。通過ExPASy網(wǎng)站（https://www.expasy.org/）的在線分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等特征信息進(jìn)行分析。

1.2 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 蛋白家族的系統(tǒng)分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

對(duì)甘藍(lán)型油菜中HAK/KUP/KT 蛋白家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。將從其他物種和甘藍(lán)型油菜中鑒定出來的HAK/KUP/KT 蛋白序列利用Clustal X 進(jìn)行多序列比對(duì)，并將比對(duì)結(jié)果利用MEGA X軟件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換對(duì)齊，然后利用鄰接法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，其中自展值（bootstrap）設(shè)置為1 000[25]。

1.3 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 基因的染色體定位與分析

根據(jù)甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因序列信息，獲得每個(gè)基因在油菜染色體上的位置信息，并利用MapChart 軟件（https://www.wur.nl/en/show/Mapchart.html）進(jìn)行染色體定位和作圖[26]。

1.4 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 蛋白序列的基序分析

利用MEME 在線工具（http://meme-suite.org/)對(duì)甘藍(lán)型油菜的HAK/KUP/KT 蛋白序列進(jìn)行基序（motif）分析，基序個(gè)數(shù)設(shè)置為10，其他參數(shù)為默認(rèn)數(shù)值。

1.5 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 基因結(jié)構(gòu)分析

從甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)庫中獲取BnHAKs基因的編碼序列（coding sequence, CDS）和非編碼區(qū)（untranslated region, UTR）信息，利用GSBS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）和TBtools（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）對(duì)基因的內(nèi)含子和外顯子進(jìn)行可視化展示。

1.6 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 基因順式作用元件分析

從甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)庫中提取BnHAKs基因的啟動(dòng)子序列（轉(zhuǎn)錄起始位置為上游1 500 bp 序列處）。順式作用元件的預(yù)測(cè)通過PLANTCARE在線網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行。

1.7 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因表達(dá)模式分析

從公開的RNA-seq 數(shù)據(jù)庫[27]下載甘藍(lán)型油菜根、莖、葉、萼片、果實(shí)和花等6個(gè)組織的表達(dá)譜數(shù)據(jù)文件，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)均一化處理后，使用MeV 4.9軟件繪制基因表達(dá)熱圖。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real?time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）分析

利用快速通用植物RNA提取試劑盒[華越洋生物（北京）科技有限公司]提取樣品RNA。第1 鏈cDNA 利用GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（GoScriptTMReverse Transcription Mix）、Oligo（dT）[普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司]合成。20 μL RT-qPCR擴(kuò)增體系：2 μL cDNA 模板，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL（引物信息如表1 所示）、10 μL Promega Eastep qPCR 主混合物和6 μL ddH2O。PCR 程序：50 ℃預(yù)變性600 s；95 ℃變性180 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸60 s，共45 個(gè)循環(huán)；從60 ℃升溫到95 ℃，進(jìn)行熔解曲線分析。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以油菜ACTIN7為內(nèi)參基因，各基因相對(duì)表達(dá)量使用2－△△CT法計(jì)算得出，并且使用軟件Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 家族成員的鑒定與分析結(jié)果

使用Blastp 方法對(duì)已報(bào)道的擬南芥、水稻與甘藍(lán)型油菜的HAK/KUP/KT蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，將所得的序列比對(duì)Pfam 數(shù)據(jù)庫，初步確定了45 個(gè)編碼HAK/KUP/KT蛋白的基因。根據(jù)這些基因在染色體上的分布位置，分別將其命名為BnHAK1～BnHAK45（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2020.08.251）。對(duì)鑒定到的45 個(gè)BnHAKs 蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜中BnHAKs蛋白的氨基酸長(zhǎng)度在204～1 526個(gè)氨基酸殘基之間，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為22.61～171.55 kDa，等電點(diǎn)范圍為4.88～9.63，大部分BnHAKs編碼堿性蛋白。

2.2 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為充分研究甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因家族的進(jìn)化關(guān)系，分別利用甘藍(lán)（23個(gè)）、白菜（19個(gè)）、擬南芥（13 個(gè)）、水稻（27 個(gè)）和大麥（25 個(gè)）的HAK/KUP/KT 蛋白序列與甘藍(lán)型油菜的45 條BnHAKs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

結(jié)果（圖1）表明，HAK/KUP/KT 家族分成2 大類，雙子葉植物油菜HAK/KUP/KT家族成員與雙子葉植物擬南芥、甘藍(lán)和白菜的親緣關(guān)系較近，而與單子葉植物水稻和大麥的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在同一亞家族內(nèi)的蛋白序列保守度較高，而不同亞家族間的差異較大，在同一亞家族內(nèi)、不同亞組之間也存在一定差異。亞家族Ⅱb的甘藍(lán)和單子葉植物水稻聚集在一起，說明該基因家族出現(xiàn)得較早，隨著物種進(jìn)化，功能比較保守；甘藍(lán)型油菜（B.napusL.，2n=AACC=38）是由甘藍(lán)（B. oleraceaL.，2n=CC=18）和白菜（B. rapaL.，2n=AA=20）通過天然種間雜交而形成的異源四倍體。甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)處于同一姊妹分支的比例高于白菜，表明甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 家族成員與甘藍(lán)的親緣關(guān)系更近，HAK/KUP/KT 家族基因可能更多的來自A 染色體，與前人對(duì)甘藍(lán)型油菜的全基因組分析結(jié)果[28]一致。

2.3 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因染色體定位結(jié)果

從HAK/KUP/KT在甘藍(lán)型油菜基因組上的分布來看，45個(gè)BnHAKs基因分布在油菜的1 922條染色體上（圖2）。其中：A01號(hào)染色體上分布得最多，有5個(gè)BnHAKs基因；A03、C04和C07這3條染色體上分布的其次，均有4 個(gè)BnHAKs基因；A02、A05、A08、C01、C02、C03、C06、C09、Cnn_random和C01_random這10條染色體上均分布2個(gè)BnHAKs基因；其余的8條染色體上均分布1 個(gè)。本研究中的45 個(gè)甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因沒有形成基因簇分布，說明甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因家族無法通過串聯(lián)重復(fù)來實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，因此，HAK/KUP/KT基因家族的擴(kuò)增可能主要為分散復(fù)制和片段復(fù)制的形式。

2.4 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 基因家族的結(jié)構(gòu)域分析

圖1 甘藍(lán)型油菜與其他植物HAK/KUP/KT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of HAK/KUP/KT proteins in B.napus and other plants

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，可以將甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因家族分成4個(gè)亞家族（圖3A）。分析表明：BnHAKs基因序列中至少含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，至多含有20 個(gè)外顯子和19 個(gè)內(nèi)含子。BnHAK10和BnHAK23都只含有4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子，是所有已鑒定的BnHAKs基因中含外顯子和內(nèi)含子最少的基因；BnHAK42含有20 個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子，是所有已鑒定的BnHAKs基因中外顯子和內(nèi)含子數(shù)量最多的基因。甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因家族含有9和10個(gè)外顯子的基因各有10 個(gè)（22.2%），含有8 和9 個(gè)內(nèi)含子的基因數(shù)量最多。在同一個(gè)組群中，外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目也不相同（圖3B）。

對(duì)每個(gè)組群進(jìn)行詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，在組群Ⅰ的2個(gè)亞組群中，只有BnHAK23和BnHAK19蛋白基序缺少較多；組群Ⅰ的基序與其他3 組基序整齊度一致；組群Ⅱ的4 個(gè)亞組群中BnHAK3、BnHAK5、BnHAK10、BnHAK20、BnHAK23、BnHAK38 和BnHAK43蛋白基序缺少較多，特別是Ⅱb亞組群的BnHAK3 蛋白基序只有2 個(gè)，保守性較差。甘藍(lán)型油菜BnHAKs 蛋白結(jié)構(gòu)域基序整體保守性較好，只有個(gè)別蛋白結(jié)構(gòu)域的基序保守性差（圖3C）。

通過MEME 在線工具對(duì)甘藍(lán)型油菜BnHAKs蛋白序列進(jìn)行分析，共鑒定出10 個(gè)保守基序（圖3D），大多數(shù)的保守基序位于K＋超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域的序列中?？偟膩碚f，這些基序幾乎均勻分布，在所有組群中，基序1、2、3、4、5、6、8、9 和10 都是保守的，只有1個(gè)基因因缺少特定基序而例外。

2.5 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 基因家族順式作用元件分析結(jié)果

圖2 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因家族的染色體定位Fig.2 Chromosome location of HAK/KUP/KT gene family in B.napus

為了進(jìn)一步研究HAK/KUP/KT基因家族在非生物脅迫反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制，對(duì)45 條甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT家族基因的上游1 500 bp序列進(jìn)行順式作用元件分析。結(jié)果（圖4）顯示了11種非生物脅迫響應(yīng)元件，包括低溫應(yīng)答元件（LTR）、赤霉素應(yīng)答元件（TATC-box）、防御和脅迫應(yīng)答元件（TC-rich repeats）、脫落酸應(yīng)答元件（ABRE）、干旱應(yīng)答元件（MBS）、茉莉酸甲酯（MeJA）應(yīng)答元件（CGTCAmotif和TGACG-motif）、水楊酸應(yīng)答元件（SARE和TCA-element）以及生長(zhǎng)素應(yīng)答元件（AuxRE 和TGA-element）。上述結(jié)果表明，多數(shù)順式元件參與激素調(diào)控和抗性相關(guān)的反應(yīng)，所以我們推測(cè)HAK/KUP/KT基因家族在調(diào)控植物的抗性和生長(zhǎng)發(fā)育的過程中發(fā)揮著重要作用。

2.6 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT 基因家族在不同組織中的表達(dá)分析

利用公開的RNA-seq 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)HAK/KUP/KT基因家族在甘藍(lán)型油菜根、莖、葉、萼片、果實(shí)和花中的表達(dá)量并繪制熱圖。在被檢測(cè)的45 個(gè)基因中，42個(gè)基因的數(shù)據(jù)來自甘藍(lán)型油菜已發(fā)表的RNA序列數(shù)據(jù)庫，而其他3 個(gè)基因（BnHAK20、BnHAK26和BnHAK38）的信息丟失，其在6 個(gè)組織中的表達(dá)量都設(shè)置為0。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，42 個(gè)BnHAKs基因的表達(dá)模式各不相同，總體而言，它們?cè)诟械谋磉_(dá)量最高，在角果中的表達(dá)量最低（圖5A 和附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2020.08.251）。

在組群Ⅰ的2 個(gè)亞組群中，除BnHAK19、BnHAK24和BnHAK34之外，其余基因在6個(gè)組織中均有表達(dá)；組群Ⅱ的4 個(gè)亞組群的大部分基因在不同組織中都有較高的表達(dá)水平，其中BnHAK41、BnHAK7和BnHAK8都在花中有較高的表達(dá)豐度，而BnHAK14只在根和莖中高表達(dá)，在其他組織中的表達(dá)量較低。

圖3 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因的系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Phylogenetic analysis and structure of HAK/KUP/KT gene and its architecture of conserved protein motifs from B.napus

為了驗(yàn)證基因表達(dá)趨勢(shì)是否正確，利用RTqPCR 分析了油菜根和葉中的基因表達(dá)情況，包括BnHAK1、BnHAK4、BnHAK9、BnHAK13、BnHAK18和BnHAK37。以甘藍(lán)型油菜‘中雙11’的第3 片真葉的RNA 為模板，基因表達(dá)結(jié)果如圖5B 所示：HAK/KUP/KT基因家族的表達(dá)具有組織特異性，其中BnHAK1在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于在根中的表達(dá)量，而BnHAK37在根中的表達(dá)豐度特別高，與轉(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)果一致。

3 討論

油菜是我國重要的油料作物，2017年油菜的種植面積約665.3萬hm2，總產(chǎn)量132.7億kg，占全國油料作物年產(chǎn)總量的38.2%，是當(dāng)前我國食用植物油的主要來源。我國油菜種植面積和總產(chǎn)均居世界第一[29]，其產(chǎn)量和品質(zhì)受K 元素的影響較大。K 是植物生存的必需元素，而K＋必須從細(xì)胞外攝取以滿足植物自身的生理需要，因此，植物對(duì)K 的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)也一直是植物生理研究的重點(diǎn)。

本研究對(duì)甘藍(lán)型油菜基因組測(cè)序，共鑒定出45個(gè)HAK/KUP/KT基因，分別命名為BnHAK1～BnHAK45。對(duì)甘藍(lán)型油菜和其他物種的HAK/KUP/KT 的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，HAK/KUP/KT 家族可以分為2 類，其中：第Ⅰ類包含的成員最少；第Ⅱ類成員最多，可分為4 個(gè)亞組，所有物種均有涉及。盡管甘藍(lán)型油菜是由甘藍(lán)和白菜通過天然種間雜交而形成的異源四倍體，但是甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)在同一姊妹分支的比例高于白菜，表明甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因家族成員與甘藍(lán)的親緣關(guān)系更近。大多數(shù)的BnHAKs旁系同源基因具有相似的基序（motif），表明它們之間的功能具有一定的保守性；也有部分旁系同源基因具有不同的基序，這部分基因可能在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了功能分化。利用MEME分析共鑒定出10個(gè)基序，其中大部分被預(yù)測(cè)為K＋轉(zhuǎn)運(yùn)域的組成部分。激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑及逆境脅迫響應(yīng)調(diào)控相關(guān)的順式元件在HAK/KUP/KT基因啟動(dòng)子區(qū)域大量存在，暗示著HAK/KUP/KT基因家族在多種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與逆境脅迫響應(yīng)的調(diào)控過程中可能發(fā)揮重要作用。

圖4 甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因家族順勢(shì)作用元件分析Fig.4 Analysis of the Cis-elements of HAK/KUP/KT gene family in B.napus

表達(dá)模式對(duì)基因功能的研究具有重要作用，BnHAKs在不同組織中的表達(dá)模式具有顯著差異。對(duì)甘藍(lán)型油菜6個(gè)組織中的HAK/KUP/KT基因家族成員分析發(fā)現(xiàn)，這45個(gè)成員具有不同的時(shí)空表達(dá)特異性，如BnHAK4、BnHAK9在葉中特異性高表達(dá)，顯示出二者對(duì)葉發(fā)育的重要性；BnHAK7 和BnHAK17在花中的表達(dá)量最高，表明它們?cè)诨òl(fā)育中具有重要作用；BnHAK11、BnHAK18和BnHAK23在根中特異性高表達(dá)，表明它們?cè)诟l(fā)育中具有重要作用。

BnHAK2、BnHAK5、BnHAK12、BnHAK22、BnHAK32、BnHAK33、BnHAK36、BnHAK39和BnHAK45在大部分組織中的表達(dá)量均較高，而BnHAK3、BnHAK19、BnHAK24、BnHAK25、BnHAK29、BnHAK34和BnHAK43在大部分組織中的表達(dá)量均較低，這說明不同HAK/KUP/KT基因家族成員的分工是不同的。

4 結(jié)論

本研究鑒定出45 個(gè)甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因，并對(duì)其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析，預(yù)測(cè)了BnHAKs啟動(dòng)子區(qū)域響應(yīng)多種激素和脅迫的調(diào)控元件，檢測(cè)了HAK/KUP/KT基因在甘藍(lán)型油菜6個(gè)組織中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步揭示甘藍(lán)型油菜HAK/KUP/KT基因家族的功能機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。