劉志明 郜苗苗 邵麗麗 朱翠敏 劉秀芬

作者單位：滄州市中心醫(yī)院兒科，河北，滄州061000

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythemato?sus，SLE）是典型的自身免疫性疾病，隨著疾病的進(jìn)展可累及多個(gè)臟器，以腎臟損傷最為常見［1］。在預(yù)測SLE 患者疾病進(jìn)展及預(yù)后方面預(yù)測難度大。既往對SLE 疾病進(jìn)展的研究主要集中在評估患者臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查參數(shù)方面，但預(yù)測效果不盡人意［2］。隨著對SLE 深入研究證實(shí)腎功能不全是SLE 預(yù)后最可靠的預(yù)測因子［3］，然而，目前尚無準(zhǔn)確預(yù)測SLE 預(yù)后的生物標(biāo)志物。Toll 樣受體9（Toll?like receptors?9，TLR9）是參與非特異性免疫的重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，廣泛表達(dá)于SLE 患者單核細(xì)胞、T 細(xì)胞和B細(xì)胞中的跨膜受體中。也有研究表明，TLR9 mRNA的表達(dá)與SLE 疾病活動性相關(guān)［4?5］。但少有研究將TLR9 mRNA表達(dá)水平用于預(yù)測SLE 疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測，基于此，本研究通過測定TLR9 mRNA的表達(dá)水平，并探討其與SLE 患者疾病進(jìn)展的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

納入2016年6月至2018年3月在本院診斷及治療的SLE 患者129 例。其中男性3 例，女性126例；平均年齡（42.87±9.78）歲；平均病程（6.74±2.12）月。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)，并確診為SLE 的患者［6］；②入組前未使用類固醇或免疫抑制劑等；③臨床資料完整；④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他器官或組織腫瘤；②合并嚴(yán)重心血管系統(tǒng)疾??；③活動性感染；④依從性差，不配合隨訪者。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 治療方法

所有入組患者均參照2010年版中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會制定的《系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷及治療指南》［7］的治療方案進(jìn)行治療，包括甲基強(qiáng)的松龍［Pfizer Italia S.r.l。（意大利），批準(zhǔn)文號H20150245］0.5 mg/kg/d，羥氯喹（上海上藥中西制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H19990263）400 mg/d，環(huán)磷酰胺（通化茂祥制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H22022673）100 mg/2d，霉酚酸鹽（上海羅氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20031277）25 mg/kg/d，環(huán)孢素（杭州中美華東制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20031277）3 mg/kg/d，甲氨蝶呤（通化茂祥制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H22022674）10～15 mg/w，硫唑嘌呤［Excella GmbH（德國），批準(zhǔn)文號H20170288］50 mg，2 次/d。

1.2.2 TLR9 mRNA 表達(dá)水平測定

收集所有患者在免疫抑制治療前和2年后的外周靜脈血樣本2 mL；在4℃，1 000 r/min 的條件下離心10 min，使用總RNA 提取試劑盒（購自Thermo Fisher Scientifc 公司）進(jìn)行提取，提取后置于-80℃冰箱保存。使用TRIzol 從全血中分離總RNA；使用BioTek SynergyTMH1 雜交解讀器測定RNA 純度；使用Takara Biotechnology 公司生產(chǎn)的PrimeScript RT 試劑盒將RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用Thermo Fisher Scientific 生產(chǎn)的SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒和ABI 7500 Real?Time PCR 系統(tǒng)檢測TLR9 mRNA相對于GAPDH 的水平；定量測量使用2?ΔΔCt方式。引物序列為：TLR9正向，5′?CTG CCT TCC TAC CCT GTG AG?3′和反向，5′?GGA TGC GGT TGG AGG ACA A?3′；GAPDH正向，5′?CGG ATT TGG TCG TAT TGG G?3′和反向，5′?TCT CGC TCC TGG AAG ATG G?3′。

1.3 觀察指標(biāo)

收集兩組患者一般資料包括年齡、性別、BMI等；實(shí)驗(yàn)室檢查資料包括持續(xù)性蛋白尿、C 反應(yīng)蛋白水平、IgG、C3、C4、IgA、IgM、SLEDAI、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、腎小球?yàn)V過率、血清肌酐等。

1.4 隨訪

兩組患者均門診隨訪2年，隨訪項(xiàng)目包括SLE病情及疾病進(jìn)展情況，對病情加重的患者調(diào)整治療方案，隨訪截止時(shí)間2020年3月17日。疾病進(jìn)展定義為在隨訪期間患者出現(xiàn)SLE 相關(guān)性死亡或活動性疾病。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Logistic回歸方程分析SLE病情及疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，繪制工作特征曲線（ROC）評估TLR9mRNA 的表達(dá)水平與SLE 病情及疾病進(jìn)展的相關(guān)性，K?M 生存曲線分析不同TRL9mRNA 表達(dá)水平的SLE 患者疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)；以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE 患者疾病進(jìn)展情況及分組

隨訪2年，截止末次隨訪時(shí)間2020年3月17日，129 例患者共5 例因不同原因失訪，共計(jì)124例患者完成隨訪，共60 例患者發(fā)生疾病進(jìn)展，將其作為進(jìn)展組，余64 例未發(fā)生疾病進(jìn)展的患者作為非進(jìn)展組。

2.2 兩組患者臨床資料比較

進(jìn)展組持續(xù)性蛋白尿、c 反應(yīng)蛋白水平、TLR9mRNA 高于非進(jìn)展組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between 2 groups［n（%），（±s）］

表1 兩組患者臨床資料比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between 2 groups［n（%），（±s）］

臨床資料年齡（歲）性別（女/男）BMI（kg/m2）吸煙持續(xù)性蛋白尿（g/d）SBP（mmHg）DBP（mmHg）c 反應(yīng)蛋白水平（mg/L）IgG IgA IgM C3 C4白細(xì)胞計(jì)數(shù)血清胱抑肽C（mg/L）尿酸（μmol/L）BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）TLR9 mRNA表達(dá)進(jìn)展組（n=60）41.45±10.47 59/1 24.42±3.51 43 23.75±1.42 146.82±10.81 95.33±10.75 6.14±1.08 21.76±4.61 3.51±0.74 1.45±0.34 0.64±0.17 0.10±0.03 613.18±100.22 2.52±0.80 363.89±78.60 8.56±2.61 73.47±22.73 40451.75±8587.21非進(jìn)展組（n=64）43.19±12.84 62/2 23.25±3.18 38 12.63±1.87 143.77±10.55 93.47±11.68 4.80±1.51 22.78±4.72 3.84±0.81 1.40±0.30 0.70±0.21 0.11±0.03 649.27±80.57 2.75±0.71 389.65±75.87 8.27±2.34 72.85±23.82 26214.77±6132.57 χ2/t 值0.618 0.279 1.450 2.066 27.760 1.186 0.689 4.249 0.908 1.768 0.647 1.306 1.384 1.646 1.262 1.385 0.485 0.111 7.905 P 值0.539 0.597 0.152 0.151<0.001 0.240 0.494<0.001 0.367 1.768 0.260 0.098 0.085 1.646 0.106 0.085 0.314 0.111<0.001

2.3 SLE 患者疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測因素分析

Logistic 多因素顯示持續(xù)性蛋白尿、c 反應(yīng)蛋白水平、TLR9mRNA 表達(dá)水平是SLE 患者疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2。

表2 多因素Logistic 分析結(jié)果Table 2 Multi?factor Logistic analysis results

2.4 兩組患者疾病進(jìn)展發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)比較

以TLR9mRNA 表達(dá)水平中位數(shù)為界值，分為TLR9 低表達(dá)組（n=62）和TLR9 高表達(dá)組（n=62）；K?M 生存分析曲線顯示，TLR9 高表達(dá)組SLE 患者2年疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)高于TLR9 低表達(dá)組（log?rankχ2=5.971，P=0.015）。見圖1。

圖1 兩組患者疾病進(jìn)展發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)比較Figure 1 Comparison of the risk of disease progression between 2 groups

2.5 TLR9 mRNA 表達(dá)水平預(yù)測SLE 疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的效能

鈣蛋白酶?1 預(yù)測TLR9mRNA 表達(dá)水平預(yù)測SLE 疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的AUC 為0.958，高于持續(xù)性蛋白尿、c 反應(yīng)蛋白水平。見表3、圖2。

表3 TLR9 mRNA 表達(dá)水平預(yù)測SLE 疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的效能Table 3 The efficacy of TLR9 mRNA expression level in predicting the risk of SLE disease progression

圖2 TLR9 mRNA 表達(dá)水平預(yù)測SLE 疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的ROC 曲線Figure 2 The ROC curve of TLR9 mRNA expression level predicting the risk of SLE disease progression

3 討論

SLE 為自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其確切機(jī)制至今尚未完全清楚［8］。TLR9 是存在于一線防御細(xì)胞上的一種識別病原體相關(guān)分子模式（pathogen?associated molecular pattern，PAMP）的受體［9］。有學(xué)者［10］應(yīng)用系列TLR 配體刺激RAW264.7 發(fā)現(xiàn)TLR 能夠上調(diào)免疫反應(yīng)；TLR 通過可能通過某種細(xì)胞反應(yīng)誘發(fā)機(jī)體自身免疫反應(yīng)或促進(jìn)自身免疫性疾病進(jìn)展。

TLR9 由TLR9mRNA 轉(zhuǎn)錄而來，是一種跨膜受體，由含亮氨酸重復(fù)序列的胞外區(qū)、含半胱氨酸的跨膜區(qū)以及具有核心元件的胞內(nèi)區(qū)組成，胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)與白介素?1 型保內(nèi)結(jié)構(gòu)域高度同源，具高度保守空間結(jié)構(gòu)，直接參與下游信號傳導(dǎo)［11］。既往研究表明［12?13］TLR9 在SLE 單核細(xì)胞、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞中高表達(dá)，活動性SLE 患者中TLR9 表達(dá)較非活動期對照升高。本研究結(jié)果提示TLR9參與了活動性SLE 的疾病進(jìn)展機(jī)制。

既往研究指出［14］血管炎、血液異常及腎小球腎炎是SLE 患者臨床無緩解的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究表明［15］腎臟、神經(jīng)功能損傷緩解是SLE 患者預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)測因素。本研究結(jié)果與以往結(jié)果部分相似，證實(shí)腎臟功能受累及c 反應(yīng)蛋白水平升高是SLE 疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。另發(fā)現(xiàn)TLR9mRNA 也是SLE 患者疾病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。ROC 曲線結(jié)果說明高水平TLR9 mRNA表達(dá)可預(yù)測SLE 患者疾病進(jìn)展。TLR9 在SLE 發(fā)病機(jī)制中的作用尚未明確。先前動物研究表明［16］TLR9的激活可導(dǎo)致MRL?Fas 狼瘡易發(fā)小鼠腎炎的進(jìn)展，可能為TLR9 的激活誘發(fā)了自身免疫反應(yīng)，影響了患者自身抗體的產(chǎn)生。在另一項(xiàng)動物研究中敲除SLE 小鼠TLR9 后小鼠抗DNA 成分自身抗體明顯減少，主要表現(xiàn)為抗核小體抗體明顯減少［17］，而在SLE 中發(fā)現(xiàn)核小體、自身抗體等在SLE 疾病的發(fā)展過程中起著重要作用。TLR9 及其信號通路與SLE自身抗體的轉(zhuǎn)型有關(guān)，在SLE 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)自身抗體IgG2a、2b亞型是致病的主要亞型［18］，對自身腎小球基底膜、DNA 等是反應(yīng)性自身抗體。TLR9 及其信號通路與自身抗體向IgG2a、2b亞型密切相關(guān)。TLR9 缺失的SLE 小鼠IgG2a、2b亞型水平明顯減少，病理損傷明顯減輕，生存期也明顯延長［19］。提示TLR9mRNA 的高表達(dá)SLE 患者存在嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)，自身免疫反應(yīng)越重，恢復(fù)越困難，致患者預(yù)后差。

綜上所述，持續(xù)性蛋白尿、C 反應(yīng)蛋白水平、TLR9mRNA 高表達(dá)是SLE 患者疾病進(jìn)展的危險(xiǎn)因數(shù)，TLR9 參與了SLE 的發(fā)病機(jī)制，TLR9mRNA高表達(dá)可能預(yù)測SLE 在2年內(nèi)的進(jìn)展情況，因此，TLR9mRNA 高表達(dá)水平可作為預(yù)測SLE 患者疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的重要生物標(biāo)志物。同時(shí)本研究還存在不足之處，本研究測量的TLR9mRNA 表達(dá)水平是機(jī)體在某一時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果，其不代表整個(gè)疾病進(jìn)展時(shí)間段。另外由于樣本量較少且來源較單一，會影響研究結(jié)果，因此后期我們將進(jìn)行大樣本、多中心、連續(xù)時(shí)間的研究。