董艷 杜安飛 辛本勤 曹佳偉

作者單位：1.日照市婦幼保健院檢驗(yàn)科，山東，日照276800

2.日照市莒縣中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東，日照276800

3.日照市中心血站，山東，日照276800

4.青島市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東，青島266000

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1］。標(biāo)準(zhǔn)治療包括原發(fā)性子宮切除術(shù)和雙側(cè)輸卵管卵巢切除術(shù)［1］，為提高復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移患者的生存質(zhì)量，個(gè)性化的分子靶向治療也在進(jìn)行研究和試驗(yàn)。研究顯示胰腺癌中miR?32?5p 表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)下調(diào)第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted onchro?mosome ten，PTEN）表達(dá)促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移［2］。宮頸癌中miR?32?5p 低表達(dá)，miR?32?5p 通過(guò)靶向同源盒B8（homeobox B8，HOXB8）抑制宮頸癌細(xì)胞惡性行為［3］。有報(bào)道稱(chēng)EC 中miR?32?5p 高表達(dá)［4］，但其在EC 中的作用并未闡明。叉頭蛋白N3（Fork head Box N3，F(xiàn)OXN3）是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，參與細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤發(fā)生等過(guò)程［5］。研究顯示FOXN3 在肝癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中顯著下調(diào)，上調(diào)FOXN3 可抑制癌細(xì)胞的上皮?間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）進(jìn)程，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，在癌癥進(jìn)展中充當(dāng)抑癌基因角色［6］。本研究通過(guò)Starbase 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR?32?5p與FOXN3可能存在靶向關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞hEEC 購(gòu)自北納生物，EC 細(xì)胞JEC 由本院子宮內(nèi)膜癌患者自愿捐贈(zèng)，EC 細(xì)胞系Ishikawa 和HEC?1A 購(gòu)自美國(guó)ATCC；McCoy's 5a 培養(yǎng)基、杜爾伯格伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；引物、miR?32?5p 模擬物（miR?32?5p）、miR?32?5p抑制劑（anti?miR?32?5p）、FOXN3 過(guò)表達(dá)載體（pcDNA?FOXN3）、FOXN3 抑制劑（si?FOXN3）和對(duì)照（miR?con、anti?miR?con、si?con 和pcDNA?con）、FOXN3 的野生型（wild type，WT）和突變型（mutant type，MUT）雙熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；FOXN3 抗體、E?鈣粘蛋白（E?Cadherin）抗體、N?鈣粘蛋白（N?Cadherin）抗體和波形蛋白（Vimentin）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；β?actin 抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑、總RNA 提取試劑盒、real?time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；光學(xué)顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、發(fā)光儀和Real?time PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio?Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染

在DMEM 高糖培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)hEEC、Ishi?kawa 和JEC 細(xì)胞，在McCoy's 5a 培養(yǎng)液中培養(yǎng)HEC?1A 細(xì)胞，培養(yǎng)液中均添加10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，培養(yǎng)條件：在飽和濕度、37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，消化傳代。以2×l06個(gè)細(xì)胞/mL 接種Ishikawa 細(xì)胞于6 孔板培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞基本融合為一層時(shí)根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞記為正常對(duì)照（NC）組（①組）。根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同分為anti?miR?32?5p 組（②組）、anti?miR?con 組（③組）、pcDNA?con組（④組）、pcDNA?FOXN3 組（⑤組）、miR?con 組（⑥組）、miR?32?5p 組（⑦組）、anti?miR?32?5p+si?con組（⑧組）、anti?miR?32?5p+si?FOXN3組（⑨組）、miR?con+WT?FOXN3 組（⑩組）、miR?32?5p+WT?FOXN3組（○1組）、miR?con+MUT?FOXN3 組（○12組）、miR?32?5p+MUT?FOXN3 組（○13組）。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，qRT?PCR 檢測(cè)Ishikawa 細(xì)胞中miR?32?5p 或FOXN3 表達(dá)水平來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT?PCR 檢測(cè)RNA 的表達(dá)

用Total RNA 提取試劑盒從EC 細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)程序?yàn)?0℃10 min，42℃30 min，99℃5 min；4℃5 min。cDNA 并檢測(cè)，然后以cDNA 為模板，按照real?time PCR 試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)，合成miR?32?5p 和FOXN3 mRNA，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃2 min；95℃30 s、60℃40 s、72℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃5 min。運(yùn)用2?ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至濃度2×105個(gè)細(xì)胞/mL，Transwell 上室加100 μL 細(xì)胞懸液，下層加含20% FBS 的培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱孵育24 h，用無(wú)菌棉簽拭去上層小室未遷移細(xì)胞，5%甲醛固定遷移細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照、計(jì)數(shù)，以平均值表示Ishikawa 細(xì)胞侵襲數(shù)量。采用Matrigel 基質(zhì)膠包被的Transwell 裝置，其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Western blot 實(shí)驗(yàn)

RIPA 裂解液室溫裂解各組Ishikawa 細(xì)胞，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。以β?actin 為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)

將構(gòu)建的WT?FOXN3 和MUT?FOXN3 分別與miR?con 或miR?32?5p 共轉(zhuǎn)染Ishikawa 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，裂解細(xì)胞，離心收集上清，直接檢測(cè)熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計(jì)算相對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)量資料以（）表示，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EC 系中miR?32?5p 和FOXN3 的表達(dá)情況

與hEEC 細(xì)胞相比，Ishikawa、HEC?1A 和JEC組細(xì)胞中miR?32?5p 表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），F(xiàn)OXN3mRNA 和蛋白表達(dá)量均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 EC 細(xì)胞系中miR?32?5p 和FOXN3 的表達(dá)情況（±s）Table 1 Expression levels of miR?32?5p and FOXN3 in EC cell lines（±s）

表1 EC 細(xì)胞系中miR?32?5p 和FOXN3 的表達(dá)情況（±s）Table 1 Expression levels of miR?32?5p and FOXN3 in EC cell lines（±s）

組別hEEC Ishikawa HEC?1A JEC F 值P 值n9 9 9 miR?32?5p 1.00±0.10 2.35±0.24 1.86±0.19 1.75±0.18 82.369 0.000 FOXN3 mRNA 1.00±0.10 0.24±0.03 0.32±0.04 0.38±0.05 290.800 0.000

2.2 miR?32?5p 低表達(dá)對(duì)Ishikawa 細(xì)胞遷移和侵襲的影響

與anti?miR?con 組相比，anti?miR?32?5p 組的Ishikawa 細(xì)胞中miR?32?5p 表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；E?Cadherin 表達(dá)升高，N?Cadherin 和Vimentin 表達(dá)量均降低（P<0.05），遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 miR?32?5p 低表達(dá)對(duì)Ishikawa 細(xì)胞遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 2 Effects of miR?32?5p low expression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

表2 miR?32?5p 低表達(dá)對(duì)Ishikawa 細(xì)胞遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 2 Effects of miR?32?5p low expression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

組別①組②組③組F 值P 值miR?32?5p 1.00±0.11 1.00±0.10 0.38±0.04 145.975 0.000 E?Cadherin 0.32±0.03 0.30±0.04 0.75±0.08 196.079 0.000 N?Cadherin 1.10±0.12 1.15±0.13 0.45±0.05 121.820 0.000 Vimentin 0.90±0.10 0.92±0.09 0.38±0.04 128.467 0.000細(xì)胞遷移數(shù)量223.05±22.50 225.46±22.34 102.78±10.38 119.350 0.000細(xì)胞侵襲數(shù)量150.43±15.27 146.45±13.65 81.16±8.11 84.173 0.000

2.3 FOXN3 高表達(dá)對(duì)Ishikawa 細(xì)胞遷移和侵襲的影響

與pcDNA?con 組相比，pcDNA?FOXN3 組的Ishikawa 細(xì)胞中FOXN3 表達(dá)量顯著升高（P<0.05），E?Cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），N?Cadherin 和Vimentin 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 FOXN3 高表達(dá)對(duì)Ishikawa 細(xì)胞遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 3 Effects of FOXN3 overexpression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

表3 FOXN3 高表達(dá)對(duì)Ishikawa 細(xì)胞遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 3 Effects of FOXN3 overexpression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

組別①組④組⑤組F 值P 值FOXN3 0.30±0.03 0.35±0.04 0.85±0.09 235.613 0.000 E?Cadherin 0.35±0.04 0.36±0.05 0.72±0.07 133.300 0.000 N?Cadherin 1.08±0.11 1.05±0.12 0.45±0.06 113.292 0.000 Vimentin 0.88±0.08 0.90±0.09 0.41±0.04 128.963 0.000細(xì)胞遷移數(shù)量225.01±22.51 224.18±22.52 98.25±9.91 129.195 0.000細(xì)胞侵襲數(shù)量153.28±15.39 148.07±15.03 72.18±7.50 107.199 0.000

2.4 miR?32?5p 靶向FOXN3

FOXN3 的3'?UTR 與miR?32?5p 的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。與miR?con+WT?FOXN3 組相比，miR?32?5p+WT?FOXN3 組Ishikawa 細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性顯著降低（P<0.05）；而與miR?con+MUT?FOXN3 組比較，miR?32?5p+MUT?FOXN3 的熒光素酶相對(duì)活性無(wú)明顯變化。與anti?miR?con組比較，anti?miR?32?5p 組Ishikawa 細(xì)胞中FOXN3表達(dá)量顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)表4、表5。

圖1 miR?32?5p 靶向調(diào)控FOXN3 表達(dá)Figure 1 miR?32?5p targets and regulates the expression of FOXN3

表4 雙熒光素酶活性檢測(cè)（±s，n=9）Table 4 Double luciferase activity assay（±s，n=9）

表4 雙熒光素酶活性檢測(cè)（±s，n=9）Table 4 Double luciferase activity assay（±s，n=9）

組別分組⑩○1○12○13 t 值P 值熒光素酶相對(duì)活性1.00±0.15 0.33±0.03 13.140 0.000 t 值P 值熒光素酶相對(duì)活性1.01±0.12 0.98±0.11 0.553 0.588

表5 Western Blot 檢測(cè)FOXN3 的表達(dá)（±s，n=9）Table 5 The expression level of FOXN3 was detected by Western blot（±s，n=9）

表5 Western Blot 檢測(cè)FOXN3 的表達(dá)（±s，n=9）Table 5 The expression level of FOXN3 was detected by Western blot（±s，n=9）

組別⑥組⑦組②組③組F 值P 值FOXN3 0.32±0.03 0.10±0.01 0.36±0.04 0.75±0.08 292.367 0.000

2.5 敲減FOXN3 逆轉(zhuǎn)miR?32?5p 低表達(dá)對(duì)Ishika?wa 遷移和侵襲的影響

與miR?32?5p+si?con 組相比，miR?32?5p+si?FOXN3 組的FOXN3 和E?cadherin 表達(dá)量顯著降低（P<0.05），N?cadherin 和Vimentin 表達(dá)顯著上升，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著上升（P<0.05）。見(jiàn)表6。

表6 敲減FOXN3 逆轉(zhuǎn)miR-32?5p 低表達(dá)對(duì)Ishikawa 遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 6 Knockdown of FOXN3 reversed the effect of downr?expression of miR?32?5p on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

表6 敲減FOXN3 逆轉(zhuǎn)miR-32?5p 低表達(dá)對(duì)Ishikawa 遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 6 Knockdown of FOXN3 reversed the effect of downr?expression of miR?32?5p on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

組別②組③組⑧組⑨組F 值P 值FOXN3 0.35±0.04 0.76±0.08 0.78±0.09 0.42±0.05 97.339 0.000 E?Cadherin 0.30±0.03 0.70±0.10 0.72±0.08 0.38±0.04 89.079 0.000 N?Cadherin 1.10±0.13 0.40±0.04 0.42±0.05 1.00±0.10 160.568 0.000 Vimentin 0.90±0.10 0.36±0.04 0.40±0.05 0.80±0.09 122.541 0.000細(xì)胞遷移數(shù)223.67±22.37 113.46±11.35 110.32±11.04 200.49±20.05 107.308 0.000細(xì)胞侵襲數(shù)151.37±15.16 80.42±8.05 82.14±8.25 131.09±13.11 85.329 0.000

3 討論

EC 多發(fā)于老年婦女，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡較前幾年有所下降［7?8］。研究EC的分子抑制靶點(diǎn)，對(duì)患者的個(gè)性化靶向治療具有重要意義。

miR?32?5p 在多種癌癥中出現(xiàn)差異表達(dá)，在癌細(xì)胞的凋亡、化學(xué)敏感性、轉(zhuǎn)移和耐藥性中起著重要作用。前列腺癌中順鉑治療后miR?32?5p 表達(dá)下調(diào)，參與調(diào)節(jié)前列腺癌化學(xué)敏感性［9］。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中miR?32?5p 高表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和遷移，舒尼替尼也通過(guò)調(diào)控miR?32?5p 發(fā)揮抑癌作用［10］。肝癌多藥耐藥細(xì)胞中miR?32?5p 表達(dá)升高，誘導(dǎo)多藥耐藥［11］。miR?32?5p 在EC 中表達(dá)上調(diào)，其具體作用和機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果表明，EC細(xì)胞系Ishikawa、HEC?1A 和JEC 中miR?32?5p 表達(dá)均顯著升高，與上述研究結(jié)果［7］一致；采用表達(dá)差異較大的Ishikawa 細(xì)胞進(jìn)行功能分析，結(jié)果表明低表達(dá)miR?32?5p 可抑制Ishikawa 細(xì)胞遷移和侵襲。說(shuō)明miR?32?5p 在EC 的發(fā)展中具有重要作用。

Starbase 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)FOXN3 的3'?UTR 與miR?32?5p 存在結(jié)合位點(diǎn)，提示兩者存在調(diào)控關(guān)系。FOXN3 編碼叉頭/翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)成員，可通過(guò)與Ski 相互作用蛋白（Ski interacting protein，SKIP）結(jié)合參與細(xì)胞基本過(guò)程調(diào)控，在腫瘤發(fā)生和對(duì)癌癥治療的反應(yīng)中起重要作用［12］。結(jié)直腸癌中FOXN3 顯著下調(diào)，被證實(shí)是N?cadherin的直接轉(zhuǎn)錄抑制因子，對(duì)腫瘤的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移均具有重要作用［13］。FOXN3 在骨肉瘤中下調(diào)，上調(diào)FOXN3 抑制骨肉瘤遷移和侵襲［14］。FOXN3 在EC中的表達(dá)和作用尚不清楚。本研究結(jié)果說(shuō)明FOXN3 在EC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中具有重要作用。此外，miR?32?5p靶向負(fù)調(diào)控FOXN3表達(dá)，敲減FOXN3部分逆轉(zhuǎn)了抑制miR?32?5p 表達(dá)對(duì)Ishikawa 細(xì)胞遷移和侵襲的影響，證實(shí)了在EC 中兩者存在調(diào)控關(guān)系。

EMT 是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要前提，在此過(guò)程中上皮細(xì)胞極性喪失，形成了一種以細(xì)胞骨架重塑和遷移活動(dòng)為特征的間充質(zhì)樣特性［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，Ishikawa 細(xì)胞中miR?32?5p 低表達(dá)和FOXN3過(guò)表達(dá)均可抑制間質(zhì)標(biāo)志物N?cadherin 和Vimentin表達(dá)，促進(jìn)上皮標(biāo)志物E?cadherin 表達(dá)，抑制EMT進(jìn)程，而敲減FOXN3 部分逆轉(zhuǎn)了抑制miR?32?5p表達(dá)對(duì)細(xì)胞EMT 的影響，這與Chen 等［16］報(bào)道FOXN3 在舌鱗癌中的抗EMT 作用吻合。

綜上所述，本研究證實(shí)，miR?32?5p 靶向FOXN3 可能通過(guò)抑制EMT 通路抑制EC 細(xì)胞的遷移和侵襲。miR?32?5p 可能是EC 的潛在分子靶點(diǎn)。