汪昕 張旭 樊垚 魏來 沈沖 薛永★

作者單位：1.江蘇省淮安市第三人民醫(yī)院檢驗科，江蘇，淮安223001

2.南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系，江蘇，南京210000

精神分裂癥（schizophrenia，SZ）是一組發(fā)病機制復雜、原因未明的精神系統(tǒng)性疾病，具有情感、意志、行為、感知等多種精神異常表現(xiàn)，以精神表現(xiàn)與現(xiàn)實環(huán)境之間的不一致為主要特點［1］。SZ 的發(fā)生涉及遺傳和環(huán)境因素的共同作用。全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome?wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)了大量與SZ 相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。鑒于CEP164基因和CENPU基因在SZ 及其他精神疾病中的研究尚未見報道，本研究通過TaqMan 基因分型技術(shù)檢測CEP164基因rs9163 位點和CENPU基因rs13478位點多態(tài)性，探討CEP164基因和CENPU基因變異與SZ 之間的關(guān)系，旨在從分子生物學角度探討CEP164基因和CENPU基因在SZ 人群中的遺傳機制，初步探索miRNA 在SZ 發(fā)生中的下游相關(guān)分子機制，為臨床診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取淮安市第三人民醫(yī)院2009年8月到2018年8月住院的SZ 患者2 555 例為病例組，其中男性1 173 例，女性1 382 例，平均年齡（34.72±13.08）歲。入選標準：符合《疾病和有關(guān)健康問題的國際統(tǒng)計分類》第10 版（ICD?10）診斷標準［2］。排除標準：腦器質(zhì)性和軀體疾病所致精神障礙、精神活性物質(zhì)所致精神障礙?；颊卟∏盁o肥胖、糖尿病、高血壓及內(nèi)分泌疾病史，無相關(guān)遺傳病史。同時選取同時期淮安市社區(qū)的健康人2 139 例為對照組，男性1 331 例，女性808 例，平均年齡（44.07±8.50）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 的提取

研究對象均在早晨空腹條件下，用EDTA 抗凝采血管采集靜脈血5 mL。在24 h 內(nèi)對血樣本進行4 000 轉(zhuǎn)離心10 min，血漿分離至1.5 mL 離心管中。剩余血樣本留存放置于-80℃冰柜中保存。DNA 提取采用酚氯仿法。

1.2.2 SNP 位點的選擇

應用生物信息學預測軟件PolymiRTS Database 3.0（2013）和NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的dbSNP 數(shù)據(jù)庫，進一步篩選重復驗證可能與SZ 相關(guān)聯(lián)的遺傳位點進行研究，最終選擇CEP164基因rs9163 位點和CENPU基因rs13478 位點。

1.2.3 基因分型

應用美國ABI 公司Taqman?MGB 探針技術(shù)完成研究對象的基因分型。針對rs9163 和rs13478兩個SNP 位點分別設計聚合酶鏈式反應（PCR）引物和TaqMan 探針，進行實時熒光PCR 擴增。PCR擴增在ABI 9700 PCR 儀上讀取，實驗結(jié)果通過分析軟件SDS 2.3 獲得。整個PCR 反應體系的體積為4.2 μL，具體包括1.6 μL 的Mix 預混液，正向引物和反向引物各0.1 μL，兩種探針各0.1 μL，去離子水1.2 μL，DNA 模板1 μL。

PCR 反應程序為：50℃預反應2 min，95℃預變10 min；PCR 擴增95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，45 個循環(huán)。rs9163 位點多態(tài)性PCR 正向引物：5′?CCACAACGGCAGCATCTCCA?3′，反向引物：5′?TCCTCCTGGGACACTTTGGGT?3′，TaqMan探針序列為5′?CAGGGCCAGGCAC?3′和5′?CCAGGG CCGGGCA?3′；rs13478 位點多態(tài)性PCR正向引物：AGGTAACAGCATGAGACTCGTCTT CCT?3′，反向引物：TCTGGGAGCCGAAAGCCATC?3′；TaqMan 探針序列為5′?TAGACTGCTCTTCT?CATC?3′和5′?TAGACTGCTTTTCTCATC?3′。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。采用多元Logistic 回歸模型分析基因位點多態(tài)性與SZ 的關(guān)聯(lián)性，計算比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI），并校正年齡、性別協(xié)變量。健康對照組基因型進行Hardy?Weinberg 平衡定律檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CEP164 基因和CENPU 基因多態(tài)性與SZ 的關(guān)聯(lián)分析

C 和T 等位基因在健康對照組中的分布頻率分別為85.6%和14.4%（rs9163 位點），67.7%和32.3%（rs13478 位點），符合Hardy?Weinberg 定律（P>0.05）。Logistic 回歸分析顯示，在調(diào)整性別和年齡后，rs9163 位點和與rs13478 位點相加模型、顯性模型和隱性模型與SZ 的關(guān)聯(lián)均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 CEP164 基因和CENPU 基因多態(tài)性與SZ 發(fā)生風險的關(guān)聯(lián)分析Table 1 Association analysis of CEP164 gene and CENPU gene polymorphism with SZ risk

2.2 CEP164 基因和CENPU 基因變異與SZ 發(fā)生風險的性別分層分析

Logistic 回歸分析顯示，在調(diào)整年齡后，無論是男性還是女性人群中，rs9163 和與rs13478 位點與SZ 關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 性別分層分析CEP164 基因和CENPU 基因多態(tài)性與SZ 的發(fā)生風險Table 2 Gender stratified analysis of CEP164 gene and CENPU gene polymorphism and the risk of SZ

2.3 CEP164 基因和CENPU 基因變異與SZ 發(fā)生風險的家族史分層分析

根據(jù)SZ 患者有無家族史為變量對研究對象分層，并調(diào)整年齡和性別，Logistic 回歸分析顯示，rs9163 和與rs13478 位點多態(tài)性與SZ 關(guān)聯(lián)均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 家族史分層分析CEP164 基因和CENPU 基因多態(tài)性與SZ 的發(fā)生風險Table 3 Stratified analysis of family history of CEP164 gene and CENPU gene polymorphism and the risk of SZ

3 討論

自2008年第1 篇關(guān)于SZ GWAS 分析的文章發(fā)表以來［3］，通過GWAS 分析已發(fā)現(xiàn)許多與SZ 相關(guān)的SNP［4?6］。以SZ 為焦點的GWAS 發(fā)現(xiàn)也具有交叉表型意義。研究發(fā)現(xiàn)rs13107325 T 等位基因與SZ、體重指數(shù)、高密度脂蛋白膽固醇、血壓以及N 端前腦鈉素（N?terminal forebrain natriuretic hor?mone，NT?proBNP）相關(guān)［7?12］。Verena 等［13］在染色體15q25.1 上的CHRNA3/CHRNA5/CHRNB4簇中發(fā)現(xiàn)了SZ 與肺癌的共同突變位點，另外兩個位點（6p22.1 和11q12.1）在肺癌和SZ 的相關(guān)組織類型中顯示交叉表型關(guān)聯(lián)和基因表達的下游多向效應。本研究尚未發(fā)現(xiàn)CEP164基因和CENPU基因位點多態(tài)性與SZ 存在顯著性關(guān)聯(lián)，是否還有其他因素，如SZ 患者的生活環(huán)境、身體活動水平、其他疾病等因素影響rs9163 和rs13478 位點多態(tài)性對SZ 的發(fā)生風險有待深入探討。

miRNA為一類長度約為18～25個核苷酸（nt）、具有高度保守性的非編碼的微小RNA，通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)（3′Non?translation area，3′UTR）結(jié)合，抑制靶基因的翻譯過程或者降解靶基因mRNA 而在基因轉(zhuǎn)錄后水平起到調(diào)控作用［14］。研究表明，精神障礙性疾病的易感基因變異及相應的生物學功能的改變與miRNA 表達量或者結(jié)構(gòu)改變有關(guān)聯(lián)［15］。本研究前期實驗表明miR?328、miR?886?5p、miR1243、miR?663b、miR?1274a 可能參與SZ的發(fā)病機制。

位于靶基因mRNA 3′UTR 區(qū)miRNA 結(jié)合位點內(nèi)的SNP 將會影響miRNA 與mRNA 的結(jié)合，從而使miRNA 對mRNA 的調(diào)控過程受阻。近年來，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)若干個位于miRNA 結(jié)合位點的SNP 對SZ的發(fā)生發(fā)展具有影響。William 等［16］發(fā)現(xiàn)miR?616與H3F3B轉(zhuǎn)錄本的結(jié)合會被位于H3F3B3′UTR 內(nèi)的rs1060120 的等位變異所改變，rs1060120 A 等位基因顯著降低了熒光素酶的表達，表明A 等位基因與miR?616的相互作用強于G等位基因，從而通過下游效應增加了SZ 譜系診斷的風險。Hou等［17］通過對GWAS SZ 相關(guān)變異位點的檢索發(fā)現(xiàn)，位于FURIN基因3′UTR 區(qū)rs4702?G 可通過增加miR?338?3p 的結(jié)合能力而參與FURIN的表達下調(diào)，而FURIN的表達量降低將導致成熟腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain de?rived neurotrophic factor，BDNF）的生成減少，后者的降低已經(jīng)報道與SZ 的發(fā)生相關(guān)。這些結(jié)果證實了位于miRNA 結(jié)合位點的SNP 可能改變SZ 的表觀遺傳機制，從而增加SZ 相關(guān)疾病的風險。本研究應用miRNA 靶基因預測軟件預測差異表達的miRNA 結(jié)合區(qū)域有2 個SNP 位點，分別為rs9163 位點和rs13478 位點，這兩位點在SZ 及其他精神疾病中的研究暫未見報道。本研究尚未發(fā)現(xiàn)這兩位點多態(tài)性與SZ 存在顯著性關(guān)聯(lián)，推測miRNA 并非通過結(jié)合rs9163 位點和rs13478 位點調(diào)控SZ 的發(fā)生，很有可能通過其他信號通路參與SZ的發(fā)生和發(fā)展。

現(xiàn)有的預測軟件或網(wǎng)站只能從生物信息學方面預測位于miRNA 結(jié)合位點的SNP 對miRNA 結(jié)合mRNA 的影響，具體的功能還需要構(gòu)建熒光報告載體驗證。本研究初步表明了CEP164基因rs9163 位點和CENPU基因rs13478 位點變異與SZ的關(guān)系。為進一步探討這兩位點與SZ 的關(guān)系，后續(xù)實驗將會檢測CEP164基因和CENPU基因在SZ 病例組和健康對照組中的表達，以及采用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CCEP164基因和CENPU基因是否是miRNA 的靶基因。