鄭鵬 王俊帥 占大錢 王敏 夏海發(fā) 劉旭東 明曉青 周代星 馮俊

摘要 目的：探討丹參酮ⅡA對心肌成纖維細胞損傷的保護作用及可能機制。方法：分離和培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細胞（Cardiac Fibroblast，CFs）。以脂多糖（LPS）刺激CFs建立膿毒癥心肌損傷體外模型，以不同濃度丹參酮ⅡA預(yù)處理CFs 30 min后，給予LPS刺激，設(shè)對照組，LPS模型組，LPS+不同濃度TSA（2 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L）組;采用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗法（Western blotting）檢測CFs的NLRP3和Caspase-1蛋白表達水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞上清中IL-1β和IL-18的含量。結(jié)果：LPS刺激24 h后，CFs的NLRP3蛋白的表達水平最高。LPS模型組NLRP3和Caspase-1蛋白的表達較對照組明顯升高（P<0.01）。與LPS模型組比較，丹參酮ⅡA（10 μmol/L、50 μmol/L）處理組NLRP3和Caspase-1蛋白的表達均明顯降低（P<0.05）;丹參酮ⅡA處理組的IL-1β和IL-18水平均明顯低于LPS模型組（P<0.05）。結(jié)論：丹參酮ⅡA能抑制LPS誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞內(nèi)NLRP3/Caspase-1炎癥反應(yīng)信號通路分子的表達，這可能是其保護心肌細胞的分子機制之一。

關(guān)鍵詞 丹參酮ⅡA;膿毒癥;心肌成纖維細胞;NLRP3/Caspase-1信號通路

Protective Effect of Tanshinone ⅡA on Cardiac Fibroblasts through the NLRP3/Caspase-1 Signaling Pathway

ZHENG Peng1，WANG Junshuai1，ZHAN Daqian1，WANG Min1，XIA Haifa2，LIU Xudong1，MING Xiaoqing1，ZHOU Daixing1，F(xiàn)ENG Jun1

（1 Department of Emergency，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430000，China; 2 Department of Anesthesia，Wuhan Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430000，China）

Abstract Objective：To explore the protecting role and mechanism of tanshinone ⅡA in lipopolysaccharide （LPS）-induced cardiac fibroblast injure.Methods：Rat cardiac fibroblasts （Cardiac Fibroblast，CFs） were Isolated and cultured.Lipopolysaccharide （LPS） was used to stimulate CFs to establish an in vitro model of septic myocardial injury.After CFs were pretreated with different concentrations of Tanshinone ⅡA for 30 min，they were given LPS stimulation.A control group，an LPS model group and LPS+different TSA （2 μmol/L，10 μmol/L，50 μmol/L） were set up.Western blotting was used to detect the NLRP3 and Caspase-1 protein expression levels of CFs，and the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the content of 1β and IL-18.Results：After 24 h of LPS stimulation，the expression level of NLRP3 protein in CFs was the highest.The expression of NLRP3 and Caspase-1 protein in the LPS model group was significantly higher than that in the control group （P<0.01）.Compared with the LPS model group，the expressions of NLRP3 and Caspase-1 protein in the Tanshinone ⅡA （10 μmol/L，50 μmol/L） treatment group were significantly reduced （P<0.05）; the level of IL-1β and IL-18 in the Tanshinone ⅡA treatment group was significantly lower than that of the LPS model group （P<0.05）.Conclusion：Tanshinone ⅡA may be a potent agent to protect against myocardial dysfunction in sepsis by regulating NLRP3/Caspase-1 signaling pathway.

Keywords Tanshinone ⅡA; Sepsis; Cardiac fibroblast; NLRP3/Caspase-1 signaling pathway

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.06.011

膿毒癥是宿主對感染的反應(yīng)異常，產(chǎn)生危及生命的器官功能損害，大約50%的膿毒癥患者存在心臟功能損害[1]。膿毒癥引起心肌損害的機制尚不明確。目前普遍認為膿毒癥患者體內(nèi)過度的炎癥反應(yīng)可能參與了心臟功能損害的過程[2-3]。在心臟的細胞組成中，心肌細胞占比低于50%，而心臟成纖維細胞（CFs）占比則高達60%。研究顯示心肌成纖維細胞發(fā)揮著感受損傷和炎癥反應(yīng)的前哨作用[4]。

Nod受體蛋白3（NLRP3）是一類重要的胞質(zhì)內(nèi)受體蛋白，它對多種物理和化學(xué)刺激做出反應(yīng)[5-6]，與Caspase-1形成的炎性小體可導(dǎo)致炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-18的成熟[7]。NLRP3炎性小體及其下游炎癥介質(zhì)IL-1、IL-18在冠狀動脈疾病或心肌梗死患者中的表達升高[8]。NLRP3炎性小體主要表達在心肌成纖維細胞上，心肌細胞上則很少[9]。心肌成纖維細胞上NLRP3炎性小體的過度激活參與了心肌缺血再灌注損傷過程。在膿毒癥心肌損傷動物模型中，NLRP3、Caspase-1均顯著上調(diào)[10]。

丹參酮ⅡA（Tanshinone ⅡA）是從中藥丹參里提取出的一種主要成分，廣泛運用于心血管疾病中[11]。研究表明，丹參酮ⅡA能通過抑制NADPH氧化酶2從而減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化[12]。此外，丹參酮ⅡA可抑制腦缺血再灌注損傷過程中NLRP3的表達[13]。動物實驗中，丹參酮ⅡA能改善膿毒癥小鼠心臟收縮功能障礙[14]，降低肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T等心肌損傷指標[15]。其作用機制未完全明確。本研究通過建立體外膿毒癥心肌損傷模型，探討丹參酮ⅡA能否影響心臟成纖維細胞上NLRP3炎性小體及其下游炎癥介質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自北京華阜康生物科技公司[許可證SCXK（京）2019-0008];本次動物實驗經(jīng)華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準（倫理審批號：HSZP-PJ-2020-001-01），符合動物倫理委員會的要求，飼養(yǎng)于同濟醫(yī)院動物實驗中心，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度55%，12 h明暗交替環(huán)境，標準飼料和水喂養(yǎng)，術(shù)前禁食不禁水。

1.1.2 藥物 丹參酮ⅡA（中國藥品生物制品檢定所，批號：110766-201721）。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠IL-1β ELISA試劑盒（R&D Systems公司，美國，貨號：RLB00），IL-18 ELISA試劑盒（R&D Systems公司，美國，貨號：DY521-05），NLRP3抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab263899），Caspase-1抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab74279），β-actin抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab115777），電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器公司，型號：DYCZ-40），電泳槽（北京六一儀器公司，型號：DYCZ-24DN），酶標儀（Thermo，美國，型號：Multiskan MK3）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將Wistar大鼠麻醉，摘除心臟，酶解（膠原酶II，2 mg/mL）心肌組織。細胞懸液通過尼龍過濾器（70 μm）后，磁珠技術(shù)去除內(nèi)皮細胞。隨后將細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min。貼壁細胞以CFs為主，移除非貼壁細胞（心肌細胞）。收集所得細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。經(jīng)鑒定成纖維細胞標志物（ER-TR7）染色陽性細胞達95%[16]。將第一代至第三代之間的細胞用于實驗。取對數(shù)生長期的CFs，以細胞濃度1×108/mL接種于10 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，分為對照組，LPS模型組，丹參酮ⅡA 2 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L）處理組。

1.2.2 給藥方法 將LPS（50 μg/mL）加入DMEM-F12培養(yǎng)基刺激CFs;鹽水作為對照添加到培養(yǎng)基中。為確定NLRP3炎性小體激活的最佳時間窗，預(yù)實驗分別用LPS刺激CFs 4、8、12、24 h，再加入3 mmol/L ATP作用30 min，以激活NLRP3炎性小體[17]。根據(jù)結(jié)果，將LPS刺激24 h的CFs用于后續(xù)實驗。丹參酮ⅡA處理組以丹參酮ⅡA預(yù)處理細胞30 min后加入LPS培養(yǎng)24 h。再加入3 mmol/L ATP作用30 min。每個濃度梯度設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.3 檢測指標與方法 1）Western blotting檢測CFs中NLRP3和Caspase-1蛋白的表達水平：將培養(yǎng)皿中的細胞用PBS洗滌后加入預(yù)冷PBS，刮下細胞，1 000 r/min，離心半徑13 cm，4 ℃離心10 min，向沉淀中加入300 μL細胞裂解液裂解細胞提取總蛋白。行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉2 h后，加入1∶1 000稀釋的NLRP3和Caspase-1一抗和1∶2 000稀釋的內(nèi)參β-actin一抗，4 ℃孵育過夜。次日TBST洗膜，1∶4 000稀釋的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜。用化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。2）ELISA檢測細胞上清中IL-1β和IL-18的含量：取對數(shù)生長期的CFs，以細胞濃度1×105/mL接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，隨后的分組和處理同上。按ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測各組細胞上清IL-1β和IL-18含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)心肌成纖維細胞NLRP3蛋白的表達? 結(jié)果顯示，LPS刺激24 h NLRP3蛋白的表達最高（P<0.05）。因此，將LPS刺激24 h的CFs用于后續(xù)實驗。見圖1。

2.2 丹參酮ⅡA抑制LPS誘導(dǎo)心肌成纖維細胞NLRP3和Caspase-1蛋白表達 LPS組NLRP3和Caspase-1蛋白的表達較對照組明顯升高（P<0.01）。與LPS模型組比較，各濃度梯度的丹參酮Ⅱ

A處理組細胞內(nèi)NLRP3（圖2A）和Caspase-1（圖2B）蛋白的表達均降低，且丹參酮ⅡA濃度越高，NLRP3和Caspase-1蛋白表達水平越低。50 μmol/L丹參酮ⅡA作用時，NLRP3和Caspase-1蛋白表達水平較LPS模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖2。

2.3 丹參酮ⅡA抑制LPS誘導(dǎo)心肌成纖維細胞IL-1β和IL-18的釋放 LPS刺激CFs后，細胞上清IL-1β和IL-18水平較對照組明顯升高[IL-1β：（383.8±36.4）pg/mL比（16.6±5.3）pg/mL，IL-18：（375.6±32.6）pg/mL比（18.5±7.2）pg/mL]。各濃度梯度丹參酮ⅡA處理組IL-1β和IL-18水平較LPS模型組均明顯降低（P<0.05）。10 μmol/L及50 μmol/L丹參酮ⅡA處理組IL-1β和IL-18水平較LPS模型組降低更顯著[IL-1β：（207.4±28.5）pg/mL，（112.6±15.8）pg/mL比（383.8±36.4）pg/mL;IL-18：（203.7±21.5）pg/mL，（106.9±16.7）pg/mL比（375.6±32.6）pg/mL]（P<0.01）。見圖3。

3 討論

膿毒癥是一種發(fā)病機制復(fù)雜的疾病，是臨床危重癥患者重要的死亡原因之一。嚴重膿毒癥和膿毒癥休克是以血流動力學(xué)改變和組織低灌注導(dǎo)致多器官功能障礙為特征。其中心臟是重要的受影響的器官。明確膿毒癥心肌損傷的機制對膿毒癥的治療非常重要。

研究表明，失控的炎癥反應(yīng)在膿毒癥心肌損傷中發(fā)揮重要作用[2-3，18]。NLRP3是一種胞質(zhì)內(nèi)的模式識別受體，它可以被感染性和非感染性信號激活。NLRP3與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）形成炎性小體，使天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）活化，促進IL-1β和IL-18的成熟和釋放[7，19]。NLRP3炎性小體主要存在于心臟成纖維細胞中，心肌細胞上則很少。而心臟成纖維細胞與心肌細胞存在交互作用，體外實驗發(fā)現(xiàn)藥物或基因?qū)用嬉种菩呐K成纖維細胞NLRP3炎性小體能增加心肌細胞環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平[9，20]，升高的心肌細胞cAMP水平間接反映了心臟收縮功能的改善。丹參酮ⅡA是治療心血管疾病的臨床常用中藥，近年來在膿毒癥中的研究也越來越多[14，21-22]。在膿毒癥小鼠模型中，丹參酮ⅡA能降低外周血炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-1β水平[14]，降低心肌活性氧族水平，改善心臟收縮功能。另一項研究中發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA能改善LPS導(dǎo)致的血流動力學(xué)紊亂[21]。然而丹參酮ⅡA在膿毒癥中的機制仍未完全明確。本研究通過LPS刺激心肌成纖維細胞構(gòu)建體外膿毒癥心肌損傷模型，發(fā)現(xiàn)LPS刺激下，心肌成纖維細胞NLRP3/Caspase-1炎癥反應(yīng)信號通路激活，下游炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-18釋放增加。丹參酮ⅡA預(yù)處理心肌成纖維細胞，能有效抑制LPS誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞NLRP3和Caspase-1蛋白表達，減少IL-1β和IL-18釋放，其作用隨丹參酮ⅡA濃度的升高而抑制程度增加，顯示丹參酮ⅡA能通過作用于心臟成纖維細胞NLRP3信號通路來發(fā)揮心臟保護作用。

本研究從細胞層面探索丹參酮ⅡA的在膿毒癥心肌損傷中的心臟保護作用機制，為丹參酮ⅡA在膿毒癥的治療中運用提供了一定的分子理論基礎(chǔ)。

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（2020-07-17收稿 責(zé)任編輯：王明）