程智超，吳文彥，宋永輝，隋 心，李夢(mèng)莎，楊立賓

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱 150040）

0 引言

1979年以來，中國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、中國城市規(guī)模越來越大、城市人口和面積也逐漸增加，由此而導(dǎo)致的城市生活垃圾也呈現(xiàn)迅猛增長的勢(shì)頭，目前已經(jīng)成為中國城市發(fā)展中的一個(gè)嚴(yán)重問題[1]。哈爾濱市是東北地區(qū)的重要城市之一，人口增長和城市化進(jìn)程也十分迅速，自1990年垃圾產(chǎn)量年遞增較快，其城市生活垃圾產(chǎn)量也呈現(xiàn)爆炸性增加。目前，哈爾濱市處理生活垃圾的方法受技術(shù)條件限制，仍以簡單填埋或直接堆放為主，而垃圾堆放過程中由于其分解緩慢，在分解過程中會(huì)產(chǎn)生含有大量有害物質(zhì)、例如有機(jī)污染物、重金屬、致病細(xì)菌等，對(duì)土壤和周圍環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[2]。土壤細(xì)菌是生態(tài)系統(tǒng)中的主要分解者[3]，對(duì)于城鎮(zhèn)生活垃圾的降解具有十分重要的作用，垃圾在土壤細(xì)菌的作用下，經(jīng)過復(fù)雜的分解、吸收、轉(zhuǎn)化反應(yīng)，將垃圾分解成無機(jī)物質(zhì)[4]。因此，探究生活垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成和多樣性，對(duì)評(píng)估垃圾堆放對(duì)環(huán)境的影響以及恢復(fù)垃圾污染造成的土壤污染具有重要意義。

目前針對(duì)城市生活垃圾的研究主要集中在垃圾堆放后對(duì)土壤理化性質(zhì)[5]和對(duì)土壤重金屬污染[6]。例如，張青青等[7]研究發(fā)現(xiàn)垃圾長期堆放導(dǎo)致土壤pH降低，而土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷、速效鉀增加；旦增等[8]通過對(duì)西藏班戈縣垃圾填埋場(chǎng)土壤環(huán)境質(zhì)量評(píng)估發(fā)現(xiàn)，垃圾場(chǎng)周邊土壤重金屬含量顯著升高。而針對(duì)生活垃圾堆放對(duì)土壤微生物的研究，國內(nèi)外學(xué)者也進(jìn)行了一些研究，例如，Tan等[9]對(duì)厭氧污泥土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行了研究；張子赟[10]對(duì)安徽合肥市垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究。黑龍江省屬于高寒地區(qū)，由于積溫少、冬季漫長，垃圾分解緩慢，土壤微生物結(jié)構(gòu)、多樣性和功能均和暖溫帶地區(qū)有顯著差異。然而，針對(duì)于東北地區(qū)，尤其是高寒地區(qū)生活垃圾堆放條件下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究一直沒有進(jìn)行深入闡明。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是二代高通量測(cè)序技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用，利用高通量測(cè)序技術(shù)，不僅可以準(zhǔn)確的揭示出土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性，而且還可以對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[11-12]。

因此，揭示黑龍江省哈爾濱市長期生活垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響就顯得尤為重要。本研究中，筆者以哈爾濱市生活垃圾堆放出的土壤和相鄰未污染土壤為研究對(duì)象，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，以期揭示高寒地區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)于生活垃圾長期堆放的變化規(guī)律，以期為合理處理生活垃圾以及土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

采樣地點(diǎn)位于黑龍江省哈爾濱市雙城區(qū)億豐生活垃圾處理廠的核心堆放區(qū)，該區(qū)域面積為70000 m2。該地區(qū)屬于溫帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫為5.1℃，年平均降水量約為569.1 mm，年日照時(shí)數(shù)約2580 h，年平均無霜期139天，平均相對(duì)濕度64%；該地區(qū)土壤類型為典型東北黑土。

1.2 樣品采集

在億豐生活垃圾處理廠選擇長期堆放的土壤區(qū)域，于2020年5月進(jìn)行取樣。按照5點(diǎn)采樣法選擇3個(gè)10 m×10 m規(guī)格的樣方，除去土壤表面垃圾物和表層土，用土鉆鉆取距離表層約0～20 cm處的土壤，將5個(gè)土樣混合均勻取1 kg裝入無菌自封袋，作為處理組(T)；同時(shí)在垃圾堆周圍50 m處，在未堆放垃圾作為空白對(duì)照，同樣用土鉆隨機(jī)鉆取5個(gè)0～20 cm處的土壤混合均勻取1 kg裝入無菌自封袋，作為對(duì)照組(C)，然后立即放入低溫保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室后過2 mm篩處理，然后置于-80℃冰箱中用于后續(xù)分析。

1.3 土壤總DNA的提取和高通量測(cè)序

土壤基因組DNA采用Fast DNA?Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，U.S.A)試劑盒進(jìn)行提取，具體方法參照使用說明。提取完的土壤基因組DNA用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)。高通量測(cè)序引物采用338F和806R對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：

DNA 1 μL、引物1 μL、PCR Reaction Mix 12.5 μL，總體積為25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min、30個(gè)循環(huán)(95℃ 1 min、52℃ 1 min、72℃ 1 min)，最后72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，高通量測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司負(fù)責(zé)完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)測(cè)序數(shù)據(jù)

測(cè)序數(shù)據(jù)采用QIIME軟件進(jìn)行處理，雙端序列使用Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)量控制，去除Barcode序列和引物序列后，用FLASH軟件拼接和過濾，用usearch軟件去除嵌合體，獲得有效序列；使用UPARSE軟件(v7.0.1090)在97%的相似度下對(duì)有效序列進(jìn)行OTU聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析將優(yōu)化序列根據(jù)Silva庫中的參考序列對(duì)OTU進(jìn)行種屬鑒定，最后獲得OTU表。Alpha多樣性指數(shù)（Chao和 ACE、Shannon和 Simpson）使用Mothur(v.1.30.2)進(jìn)行計(jì)算。功能分析使用PICRUSt(v2.0.0)軟件在線分析完成。Venn圖、物種豐度圖等用R實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果

對(duì)無生活垃圾覆蓋(C)和有生活垃圾覆蓋(T)處理的土壤細(xì)菌16S rRNA基因序列的V4可變區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，分別得到113294和106606條序列，在剔除引物、低質(zhì)量序列后，分別得到85435和76432條有效序列。對(duì)有效序列基于97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，處理組和對(duì)照組一共得到4579個(gè)有效的OTU，分別為2538和2041個(gè)；在門水平得到53個(gè)分類單元，2個(gè)處理分別為52和52個(gè)；在屬水平得到586個(gè)分類單元，2個(gè)處理分別為559和484個(gè)。

2.2 土壤細(xì)菌多樣性

2個(gè)處理的土壤細(xì)菌Alpha多樣性結(jié)果見表1。由表1可知，處理組的Chao1和ACE指數(shù)均比對(duì)照組低14.47%和15.01%，無生活垃圾覆蓋的土壤細(xì)菌具有更高的豐富度；處理組的Shannon指數(shù)低于對(duì)照組6.45%，而Simpson指數(shù)高于對(duì)照組，沒有生活垃圾覆蓋的土壤物種多樣性更高。2組樣本的測(cè)序覆蓋率均在98%以上，說明取樣合理，測(cè)序數(shù)據(jù)能夠真實(shí)反映土壤樣品中的微生物群落。

表1 土壤樣品的微生物多樣性指數(shù)

2.3 土壤細(xì)菌組成土壤細(xì)菌群落組成

2個(gè)處理的土壤細(xì)菌群落組成見圖1和2。分析結(jié)果表明：在門水平，處理組與對(duì)照組的土壤細(xì)菌組成非常相似，相對(duì)豐度均以變形菌門(Proteobacteria)為最高，在2處理中分別為40.3%和42.6%，其次依次為擬桿菌門(Bacteroidetes)(21.7%、9.1%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(5.9%、12.9%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(7.3%、7.3%)、放線菌門(Actinobacteria)(4.2%、3.8%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(2.3%、3.9%)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)(5.0%、1.0%)、Ignavibacteriae(2.0%、3.3%)（圖1）。相較于對(duì)照組，處理組中變形菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、Ignavibacteriae的相對(duì)豐度增加，其中綠彎菌門增加幅度最大，為7.0%；而擬桿菌門、放線菌門、藍(lán)細(xì)菌門等相對(duì)豐度減少，其中擬桿菌門減少幅度最大，為12.6%。

圖1 不同處理土壤樣品在門分類水平上細(xì)菌組成

在屬水平上，2組處理均以黃單胞菌科的相對(duì)豐度最高，分別為5.1%和5.9%（圖2）。硫化細(xì)菌屬(Bacillus)的相對(duì)豐度最高，分別為3.1%和7.3%（圖2）。相較于對(duì)照組，處理組中硫化細(xì)菌屬(Bacillus)、厭氧繩菌屬(Anaerolineaceae)、生孢噬胞菌屬(Saprospiraceae)的相對(duì)豐度增加，分別增加4.3%、5.1%、1.4%；黃桿菌屬(Flavobacterium)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、噬纖維菌科(Cytophagaceae)的相對(duì)豐度減少，分別減少38.2%、17.3%、14.2%。

圖2 不同處理土壤樣品在屬分類水平上細(xì)菌組成

在細(xì)菌門水平上，垃圾堆放和對(duì)照土壤細(xì)菌門水平差異結(jié)構(gòu)分析見圖3A。從圖3A可以看出，與對(duì)照相比，垃圾堆放顯著提高了土壤Chloroflexi、Gemmatimonadetes、 Aminicenantes、 Parcubacteria、Spirochaetae的豐度(P＜0.05)；但是卻顯著降低了土壤Bacteroidetes、Chlorobi、Saccharibacteria的豐度 (P＜0.05)。

在細(xì)菌屬水平上，垃圾堆放和對(duì)照土壤細(xì)菌屬水平差異結(jié)構(gòu)分析見圖3B。與對(duì)照相比，垃圾堆放顯著提 高 了 土 壤 Desulfatiglaus、Gemmatimondaceae、Ignavibacterium、Xanthomonadales的豐度，而顯著降低了土壤Flavobacterium的豐度。

圖3 垃圾堆放對(duì)土壤細(xì)菌群落門(A)和屬(B)水平的差異分析

通過Venn圖分析2個(gè)處理土壤細(xì)菌共有的OTU數(shù)量及特有的OTU數(shù)量，共有的OTU數(shù)量有1775個(gè)，占總數(shù)的63.3%，對(duì)照組特有的屬數(shù)量有763個(gè)，占總數(shù)的27.2%，處理組特有的屬數(shù)量有266個(gè)，占總數(shù)的9.5%（圖4）。

圖4 不同處理土壤細(xì)菌在屬分類水平上的Venn圖

2.4 土壤的細(xì)菌功能性預(yù)測(cè)

通過對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)進(jìn)行比對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果（表2），發(fā)現(xiàn)在KEGG一級(jí)功能層中有6個(gè)代謝通路：代謝(Metabolism)、環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、細(xì)胞過程(Cellular processes)、人類疾病(Human Diseases)、有機(jī)體系統(tǒng)(Organismal Systems)，其中代謝功能的占比最高，處理組中達(dá)到了10.47%，對(duì)照組為10.18%。在基因二級(jí)功能預(yù)測(cè)分析中發(fā)現(xiàn)由氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、膜運(yùn)輸(Membrane transport)、復(fù)制和修復(fù)(Replication and Repair)、能量代謝(Energy metabolism)、輔助因子和維生素的代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)、類脂化合物代謝(Lipid metabolism)、核苷酸代謝(Nucleotide metabolism)、信號(hào)傳導(dǎo)(Signal transduction)、類脂化合物代謝(Lipid metabolism)等41個(gè)子功能組成（表2）。相較于對(duì)照組，處理組中的膜運(yùn)輸、復(fù)制和修復(fù)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等功能增強(qiáng)，相對(duì)豐度分別升高0.85%、0.02%、0.43%；氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝、類脂化合物代謝等功能有所降低，相對(duì)豐度分別降低0.29%、0.16%、0.11%、0.09%、0.27%。

表2 土壤細(xì)菌群落功能豐度表

續(xù)表2

3 結(jié)論

生活垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌群落alpha多樣性顯著降低，而且垃圾堆放改變了土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成，但是土壤細(xì)菌主要的功能并未發(fā)生顯著改變，其一級(jí)代謝功能均為代謝，二級(jí)代謝功能均為氨基酸和碳水化合物代謝。因此，為降低垃圾堆放對(duì)土壤微生物的影響，還需要進(jìn)一份對(duì)生活垃圾進(jìn)行分類及無害化利用。本研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步探究生活垃圾堆放對(duì)土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而且對(duì)于未來合理利用生活垃圾提供理論參考。

4 討論

4.1 垃圾堆放對(duì)土壤細(xì)菌多樣性的影響

本研究通過對(duì)哈爾濱市生活垃圾處理堆放區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析發(fā)現(xiàn)，長期垃圾堆放導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落Shannon多樣性指數(shù)和Chao多樣性指數(shù)顯著降低（表1）。這與張子赟[10]的研究結(jié)果一致。這表明長期的生活垃圾堆放會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落多樣性降低，垃圾堆放過程中所產(chǎn)生的大量有機(jī)化合物、有毒物質(zhì)、重金屬、病毒、寄生蟲等會(huì)影響土壤原有細(xì)菌群落多樣性，使得土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度顯著下降，而土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度的下降會(huì)導(dǎo)致土壤質(zhì)量變差，土壤自身難以恢復(fù)到之前的原有狀態(tài)。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，垃圾長期堆放后土壤細(xì)菌多樣性和豐富度會(huì)顯著升高[13]。這說明生活垃圾堆放對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響是不同的，究其原因可能是生活垃圾含有大量廚余垃圾和含有大量營養(yǎng)元素的垃圾，這些垃圾含有細(xì)菌生長和繁殖所急需的養(yǎng)料，因此會(huì)顯著提高土壤微生物的多樣性和豐富度。而且垃圾堆放的深度[14]、生活垃圾種類[15]、堆放時(shí)間[16]、垃圾堆放區(qū)域[17]、土壤質(zhì)地[18]等均會(huì)影響土壤微生物多樣性和豐富度，因此需要從時(shí)空上對(duì)垃圾堆放對(duì)土壤微生物的影響進(jìn)行分析。

4.2 垃圾堆放對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，垃圾堆積堆放與未堆放在土壤細(xì)菌門水平組成相似，但是其相對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門不同。垃圾堆放土壤細(xì)菌主要以變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門和酸桿菌門為主。吳雙等[19]對(duì)北京市北神樹生活垃圾填埋場(chǎng)的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，垃圾堆放中土壤細(xì)菌門衛(wèi)變形菌門，這也本研究的結(jié)果一致。而且，何芝等[20]對(duì)山東、廣東、上海、重慶生活垃圾堆放土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果也同樣發(fā)現(xiàn)變形菌門是最主要的細(xì)菌門。

和未堆放生活垃圾的土壤相比，垃圾堆放顯著增加了土壤綠彎菌門、芽單胞菌門的豐度。綠彎菌是一個(gè)廣泛分布與土壤中的細(xì)菌門，其營養(yǎng)方式和代謝途徑十分豐富，參與大量元素循環(huán)和分解過程，其廣泛分布與活性污泥和堆肥等生境中[21]。芽單胞菌門是一類寡養(yǎng)土壤單胞菌，大量分布在逆境生境中，具有較強(qiáng)的分解能力[1]。本研究中，生活垃圾中含有大量的有毒重金屬等物質(zhì)，因此導(dǎo)致垃圾堆放土壤中綠彎菌門、芽單胞菌門含量增加。

在屬水平，垃圾堆放條件下，土壤中Desulfatiglaus、Gemmatimondaceae、Ignavibacterium、Xanthomonadales顯著升高。Gemmatimondaceae環(huán)境樣品中的含量豐富的細(xì)菌屬，該屬的細(xì)菌通常具有較強(qiáng)的降解纖維素能力，而且還具有重要的降解芳香族化合物和重金屬絡(luò)合物的能力，通常分布在高溫、鹽堿等逆境土壤中，通常是生活垃圾填埋場(chǎng)環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)屬[22]。生活垃圾填埋條件下土壤中逆境微生物含量的增加，對(duì)于利用土壤中逆境微生物來進(jìn)行土壤修復(fù)具有十分重要的作用，這種菌屬可以為開發(fā)微生物菌劑提供了寶貴的微生物資源。但是同時(shí)筆者也發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，土壤中還含有大量未知和未分類的細(xì)菌，對(duì)于這些細(xì)菌分類和功能還需要未來進(jìn)一步的研究。

4.3 垃圾堆放對(duì)土壤細(xì)菌功能的影響

目前雖然已經(jīng)開展了一些針對(duì)于垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究[23-24]，但是針對(duì)垃圾堆放條件下土壤細(xì)菌功能的研究缺仍然缺乏。本研究采用PICRUSt功能預(yù)測(cè)方式對(duì)垃圾堆放下土壤細(xì)菌功能進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在一級(jí)代謝水平上，垃圾堆放和未堆放土壤細(xì)菌功能均以代謝功能為主，土壤細(xì)菌功能基因多樣性差異不大，但是在基因功能的豐度上出現(xiàn)了一定差異，未堆放組要高于堆放組。

在二級(jí)功能代謝水平上主要是氨基酸代謝(Amino Acid Metabolism)和碳水化合物代謝(Carbohydrate Metabolism)途徑，未堆放土壤高于垃圾堆放土壤0.29%和0.16%，這可能是因?yàn)樯罾逊胚^程中土壤有益細(xì)菌發(fā)生改變，主要以逆境微生物為主，因此導(dǎo)致微生物功能的降低[25]。其中垃圾堆放土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門中變形菌門具有降解動(dòng)植物殘?bào)w、固氮及參與單碳化合物代謝等功能[26]。在垃圾堆放組的優(yōu)勢(shì)菌屬中，芽孢桿菌屬是一類主要利用單糖、雙糖、淀粉、有機(jī)酸等作為碳源和能源的細(xì)菌[27]。相較于未堆放土壤，垃圾堆放土壤細(xì)菌中膜運(yùn)輸、復(fù)制和修復(fù)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的代謝增加幅度最大。雖然本研究利用PICRUST在線預(yù)測(cè)了土壤中細(xì)菌的功能，但是由于該方法只能對(duì)已知的微生物進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，而對(duì)于大量未知的微生物是無法進(jìn)行分析的，因此在未來需要進(jìn)一步采用宏基因組方法，更加深入的探討垃圾堆放下土壤細(xì)菌功能的改變。