宋凱 潘樂 李智斌 王官林 孫曉潔 劉康 唐少雄 楊利學(xué)△

腰椎間盤突出癥(Lumbar Disc Hernation，LDH)是引起中老年人腰痛的重要因素[1]，LDH主要由椎間盤的退變引起，且發(fā)現(xiàn)椎間盤細(xì)胞的活性變化和炎性變化對(duì)椎間盤的退變起重要作用[2]。研究表明益氣活血補(bǔ)腎可以降低炎性因子在退變型髓核細(xì)胞中的表達(dá)，使得細(xì)胞外基質(zhì)降解，加速退變型髓核的重吸收[3-4]。本實(shí)驗(yàn)采用右歸丸為補(bǔ)腎方藥代表，桃紅四物湯為活血方藥代表，研究各組含藥血清干預(yù)肝腎虧虛型人退變髓核細(xì)胞后細(xì)胞活力及炎性因子表達(dá)的變化。并根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論驗(yàn)證右歸丸含藥血清干預(yù)肝腎虧虛型退變髓核細(xì)胞效果優(yōu)于桃紅含藥血清組，從側(cè)面進(jìn)一步論證了辨證論治的科學(xué)性。

1 材料與方法

1.1病例資料

選擇2019年6月至2019年12月就診于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱骨科辨證分型為肝腎虧虛型的腰椎間盤突出癥手術(shù)患者。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)備案同意，患者簽署知情同意書后，手術(shù)中獲取相關(guān)廢棄髓核組織作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)

按照LDH的中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：1)經(jīng)倫理委員會(huì)同意且患者自愿簽署知情同意書；2)查體符合LDH[5]；3)經(jīng)CT或MRI檢查證實(shí)；4)中醫(yī)辨證屬肝腎虧虛型[6]；5)具備手術(shù)適應(yīng)證，行椎間盤髓核摘除術(shù)；6)20～50歲。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn)

1)不滿足納入標(biāo)準(zhǔn)的患者；2)存在心腦血管、腫瘤等其他嚴(yán)重疾患；3)存在結(jié)核、乙肝等傳染性疾病的疾患；4)不愿意參與調(diào)查研究治療流程的患者。

1.4標(biāo)本來源

來源于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科符合納排標(biāo)準(zhǔn)的住院患者，共3例。手術(shù)中獲取廢棄髓核組織，將手術(shù)取得的新鮮髓核組織置于含有醫(yī)用生理鹽水的25 mL無(wú)菌離心管中，立即送往陜西中醫(yī)藥大學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離及培養(yǎng)。

1.5試劑與儀器

胎牛血清(FBS)(西安博達(dá)技術(shù)有限公司)；青鏈雙抗(西安博達(dá)技術(shù)有限公)司；BCA試劑盒(Thermo Scientific飛世爾科技公司)；WB配膠試劑盒(Bio-Rad公司)；兔抗人IL-1(ABCAM)；兔抗人TNF-α(ABCAM)。倒置相差顯微鏡(尼康中國(guó)有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(皓莊儀器有限公司)；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、電泳槽、PVDF膜、曝光儀(Bio-Rad公司)。

1.6方法

1.6.1含藥血清的制備 選取6～8周齡健康SD大鼠48只，雌雄各24只，按照隨機(jī)分配原則分成空白對(duì)照組、桃紅四物湯組、右歸丸組，每組16只(雌性、雄性各8只)。右歸丸組成：熟地24 g，山萸肉9 g，枸杞子9 g，當(dāng)歸9 g，菟絲子12 g，鹿角膠12 g，山藥12 g，杜仲12 g，附子6 g，肉桂6 g。桃紅四物湯組成：當(dāng)歸15 g，熟地15 g，川芎15 g，白芍15 g，桃仁10 g，紅花10 g。藥物加水400 mL，浸泡0.5 h，水煎30 min，水煎至100 mL。根據(jù)動(dòng)物與人體的每千克體質(zhì)量折算系數(shù)表[7]計(jì)算各組大鼠灌胃藥量，所得右歸丸組大鼠每次灌胃量約為5.72 g/kg(250 g SD大鼠每次灌胃量約1.43 mL)，桃紅四物湯組大鼠每次灌胃量約4.17 g/kg(250 g SD大鼠每次灌胃量約1.26 mL)。每天9點(diǎn)、16點(diǎn)灌藥，連續(xù)5 d，最后一次灌胃1 h后腹主動(dòng)脈采血。血樣裝入離心管，以 3 000 r/min 離心15 min，吸取上層液體，放在56 ℃恒溫水浴鍋中滅活30 min。隨后進(jìn)行過濾、滅菌，最后置于-20 ℃下冷凍備用，每次根據(jù)要求配制相應(yīng)濃度。

1.6.2退變髓核細(xì)胞的培養(yǎng) 剪取髓核組織，采用0.25%胰蛋白酶消化，加入20% FBS、1%雙抗終止消化，離心后接種至25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并拍照記錄。待細(xì)胞生長(zhǎng)接近90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.6.3MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 胰酶消化后接種細(xì)胞于96孔板，按分組進(jìn)行不同濃度培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入含藥血清，分別于6、12、24、48、72 h進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(OD)，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6.4Western Blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)IL-1、TNF-α表達(dá)的變化 實(shí)驗(yàn)分組：空白血清組、桃紅血清組、右歸血清組。不同含藥血清梯度濃度干預(yù)培養(yǎng)后，分別在第3、7、14天收集細(xì)胞，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，主要步驟包括：1)提取細(xì)胞蛋白，取出細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗一遍，按比例加入RIPA裂解液和PMSF，用移液槍吹打數(shù)次。約2 min充分裂解后，吸至離心管，12 000g，4 ℃離心10 min，取上清，用BCA法測(cè)蛋白濃度，并將上清制備成樣品儲(chǔ)備液。2)取適量的樣品加入上樣孔內(nèi)，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗，每次孵抗體結(jié)束后，都用TBST(1X)洗膜3次，每次10 min。最后將洗后的PVDF膜用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白條帶。用Image J軟件測(cè)定蛋白灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)的灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，每組重復(fù)6次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1髓核細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)變化

經(jīng)胰酶消化法培養(yǎng)后，髓核細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)變化見圖1。

(a)～(d) 分別為第1、3、7、14天原代髓核細(xì)胞；(f) 二代髓核細(xì)胞圖1 髓核細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)變化

2.2不同濃度含藥血清干預(yù)下細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

從圖2-圖4可以看出，10%空白血清、20%桃紅四物湯含藥血清及20%右歸丸含藥血清更有利于髓核細(xì)胞生長(zhǎng)，且含有藥物血清的兩組細(xì)胞生長(zhǎng)活力更強(qiáng)。

圖2 空白對(duì)照組大鼠含藥血清干預(yù)后OD值

圖3 桃紅四物湯組大鼠含藥血清干預(yù)后OD值

圖4 右歸丸組大鼠含藥血清干預(yù)后OD值

2.3各時(shí)間點(diǎn)IL-1、TNF-α表達(dá)的變化

Western Blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)IL-1、TNF-α表達(dá)的變化，見圖5-圖7及表1-表2。

圖5 第3天各組IL-1和TNF-α的表達(dá)水平

圖6 第7天各組IL-1和TNF-α的表達(dá)水平

圖7 第14天各組IL-1和TNF-α的表達(dá)水平

從表1-表2可以看出：3組細(xì)胞經(jīng)3、7、14 d培養(yǎng)后，與空白血清組相比，桃紅血清組及右歸血清組IL-1和TNF-α均有下降，經(jīng)F檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；右歸血清組較桃紅血清組下降更加明顯，經(jīng)F檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組分別在第3、7、14天的TNF-α表達(dá)水平

表2 各組分別在第3、7、14天 的IL-1表達(dá)水平

3 討論

據(jù)腰椎間盤突出癥的典型臨床癥狀表現(xiàn)，屬中醫(yī)學(xué)中的“腰痛”“痿證”范疇[8]?！端貑枴っ}要精微論》云“腰者，腎之府，轉(zhuǎn)搖不能，腎將憊矣”?！兜は姆ā吩啤梆鲅卵凑?，稱瀝血腰痛，與跌仆閃挫，或碰撞所傷，或腰痛經(jīng)久，瘀血凝積而成”。腰痛病主要病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以腎虛為關(guān)鍵，標(biāo)實(shí)為瘀血、痰飲等，主要表現(xiàn)為“不通則通、不榮則痛”，引起腰骶部的疼痛不適等癥狀。右歸丸[9]以溫補(bǔ)腎陽(yáng)、填精益髓為功用，主治腎陽(yáng)不足，命門火衰證。桃紅四物湯主要功用為養(yǎng)血活血，主治血虛血瘀證。研究表明[10]補(bǔ)腎活血中藥可促進(jìn)椎間盤髓核細(xì)胞增長(zhǎng)，抑制髓核細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的合成，緩解髓核細(xì)胞的凋亡，并且認(rèn)為“肝主筋、腎主骨”與LDH的發(fā)生具有密切聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，右歸丸及桃紅四物湯大鼠含藥血清可以促進(jìn)體外髓核細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且可以降低IL-1、TNF-α表達(dá)，且右歸丸含藥血清在降低同證型患者髓核細(xì)胞炎性因子表達(dá)方面，效果更為顯著。相關(guān)研究表明[11]促進(jìn)髓核細(xì)胞的生長(zhǎng)與控制炎癥因子的表達(dá)對(duì)于延緩椎間盤的退變有重要的意義。研究顯示椎間盤的內(nèi)源性穩(wěn)定遭到破壞，椎間盤內(nèi)的炎癥因子水平增加，炎癥因子的介入可導(dǎo)致蛋白多糖和膠原的降解，并影響多糖和膠原的分泌及生成，最終加快腰椎退變的速度[12]。炎癥因子主要有IL-1、IL-6、IL-2、IL-4、TNF-α、前列腺素2(PGE)、IFNγ、趨化因子等，但目前研究較多的為IL-1和TNF-α。IL-1和TNF-α可使基質(zhì)金屬蛋白(metal matrix proteinase，MMPs)的表達(dá)上升，該類蛋白降低多糖和Ⅱ型膠原的生成，并促進(jìn)Ⅰ型膠原的生成，Ⅰ型膠原可促使椎間盤細(xì)胞的纖維化，最終出現(xiàn)軟骨細(xì)胞變性、壞死[13]。炎癥因子可導(dǎo)致并加速椎間盤的退變，腰椎間盤的退變也會(huì)誘導(dǎo)炎癥因子的水平，二者相互影響。陳江等[14]通過益腎通絡(luò)活血方干預(yù)椎間盤細(xì)胞，通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)Caspase-3和CollagenⅡ的表達(dá)，抑制MMP-13、NF-κB、p65、ADAMTS-4來增加細(xì)胞活性，減少髓核細(xì)胞的凋亡，緩解髓核細(xì)胞的退變。Hong等[15]發(fā)現(xiàn)肉桂水提取物對(duì)小鼠血清進(jìn)行干預(yù)可抑制 IL-6和TNF-α水平的表達(dá)，降低血清中的炎癥因子，可緩解炎癥反應(yīng)。右歸丸及桃紅四物湯在臨床中可以有效的治療腰椎間盤突出癥，可能與增加髓核細(xì)胞生長(zhǎng)及降低炎性反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過體外研究證實(shí)右歸丸含藥血清和桃紅四物湯含藥血清都有利于退變髓核細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可降低炎癥因子IL-1、TNF-α的表達(dá)，且針對(duì)肝腎虧虛型退變髓核細(xì)胞，右歸丸的作用更為顯著，這將為臨床使用右歸丸治療肝腎虧虛型LDH提供理論依據(jù)。同時(shí)從側(cè)面反映了同證型方藥對(duì)該證型退變髓核細(xì)胞干預(yù)效果較優(yōu)，進(jìn)而體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的科學(xué)性。