曹林忠 鄔明峻 蔣瑋 王多賢 張琪 劉孟初 馬學強

激素性股骨頭壞死(SANFH)是由于臨床中糖皮質激素(GC)不規(guī)范使用或長期大量應用而引起的嚴重骨科疾病[1]。SANFH是治療比較困難的一種骨關節(jié)疾病，沒有及時發(fā)現(xiàn)和治療導致股骨頭塌陷后會引發(fā)髖關節(jié)骨關節(jié)炎，致使患者生活質量降低，社會及家庭經濟負擔加重。GC引起的BMSCs成骨-成脂分化失衡是SANFH發(fā)生的主要機制之一[2]，miRNA-708在GC相關疾病及多種骨科疾病中發(fā)揮了關鍵的調控作用。實驗表明miRNA-708在SANFH患者股骨頭組織中呈過表達，GC可導致BMSCs的miRNA-708表達水平增高[3]。但GC損傷機體骨組織分子機制不明確，臨床尚未發(fā)現(xiàn)有效治療藥物。因此，如何有效阻斷SANFH的進展，促進受損股骨頭組織的恢復，是現(xiàn)代醫(yī)學研究的重點。近年來，中醫(yī)藥防治SANFH取得了較好的臨床療效，生骨再造丸治療早期SANFH療效顯著，但其確切的作用機制及更有效的治療方法仍是當下研究的熱點、難點[4]。本實驗研究驗證SANFH的發(fā)生與miRNA-708的相關性，明確生骨再造丸是通過抑制miRNA-708的表達以阻斷SANFH的進展，從而為中醫(yī)藥防治SANFH提供分子生物學理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物

2.5個月齡健康普通級新西蘭大白兔，50只，雄性，1.8～2.2 kg，西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物質量合格證號為SCXK(川)2018-17。

1.2實驗藥物及試劑

生骨再造丸(170803，甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院)；仙靈骨葆膠囊 (190106，國藥集團同濟堂制藥有限公司)；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(X60842，Pfizer Manufacturing Belgium NV)；LPS(1001164401，SIGMA)；注射用青霉素鈉(F8122301，華北制藥股份有限公司)；L-DMEM培養(yǎng)基(CGM103.05，Cellmax)，H-DMEM培養(yǎng)基(CGM102.05，Cellmax)，堿性磷酸酶顯色試劑盒(MA0197，大連美侖生物技術有限公司)，OriCell，間充質干細胞成骨誘導分化培養(yǎng)基試劑盒(RBXMX-90021，廣州賽業(yè)生物)，油紅O染色試劑盒(G1261，北京索萊寶)，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(638313，Clontech)，流式抗體CD29(bs-0486R-PE)、CD34(bs-0646PE-cy7)、CD44(bs-2507R-APC)、CD45(bs-0522R-FITC)均購自北京博奧森；TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(RR920A，Takara)，miRNA-708-3p、miRNA-708-5p引物交由Takara公司設計。

1.3實驗儀器

生物超凈工作臺(江蘇蘇凈安泰公司)；搖床(北京六一儀器廠)；離心機(BECKMAN COULTER)；梯度PCR儀(Biometra)；實時熒光定量PCR擴增儀(Roch)。

1.4方法

1.4.1造模方法 實驗組采用LPS聯(lián)合甲潑尼龍琥珀酸鈉法造模[5]，耳緣靜脈注射LPS(10 μg/kg)、臀肌注射甲潑尼龍琥珀酸鈉(20 mg/kg)，1次/d，共3次，臀肌處注射青霉素以預防感染?？瞻捉M給予耳緣靜脈與臀肌注射等量生理鹽水和青霉素。28 d后MRI驗證造模成功。

1.4.2分組方法 將50只普通級新西蘭大白兔按隨機數(shù)字表法分為空白組10只，實驗組40只，實驗組造模成功32只，按照隨機數(shù)字表法分為模型組10只，仙靈骨葆組11只，生骨再造丸組11只(兔的藥物灌胃為有創(chuàng)操作，操作不當會引起死亡，導致藥物干預失敗，根據實際造模情況，藥物組模型數(shù)量為11只)。

1.4.3干預方法 仙靈骨葆組以0.4 g/kg仙靈骨葆、生骨再造丸組以0.6 g/kg生骨再造丸灌胃28 d[6]，空白組和模型組給予生理鹽水灌胃。

1.4.4標本制作方法 藥物干預28 d后，仙靈骨葆組和生骨再造丸組各選取灌胃成功的10只，空氣栓塞法處死，取出兩側股骨。Percoll法分離各組BMSCs，完全沖出骨髓，重懸、離心，棄上清，加入L-DMEM完全培養(yǎng)液重懸，鋪于等量的Percoll分離液上，離心吸取白膜層，洗滌2次，棄上清；酶消法分離各組OB，將分離處理好的股骨頭碾碎，加入適量胰蛋白酶，恒溫搖床中預消化后離心，棄上清，加入3～5 mL 0.1%Ⅰ型膠原酶，恒溫搖床中消化后離心，棄上清；密度梯度離心法分離各組脂肪細胞，將股骨從中間剪斷，完全沖出骨髓，重懸、離心，吸取上層脂肪層；提取的BMSCs、OB、脂肪細胞加入5 mL H-DMEM完全培養(yǎng)基，移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時換液。

1.5實驗指標測定

1.5.1BMSCs、OB和脂肪細胞的鑒定 各組P1代BMSCs、OB培養(yǎng)至約90%融合時流式細胞技術鑒定，培養(yǎng)至約90%融合時再誘導分化培養(yǎng)2～3周，BMSCs用堿性磷酸酶染色鑒定，OB用茜素紅染色鑒定。初代脂肪細胞用油紅O染色鑒定。

1.5.2qRT-PCR檢測miRNA-708-3p和miRNA-708-5p 各組P1代90%融合的BMSCs、OB和初代脂肪細胞中加入MagZolTMReagent提取并測定各組細胞總RNA，miRNA按照試劑盒說明步驟反轉錄合成cDNA，qRT-PCR檢測miRNA-708-3p和miRNA-708-5p表達水平。

1.6統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1MRI驗證結果

造模28 d，隨機抽取8只行MRI驗證，股骨頭關節(jié)面及關節(jié)間隙正常，股骨頭前上部T1WI為低信號、T2WI為高信號(見圖1)。

圖1 造模后影像資料

2.2BMSCs、OB、脂肪細胞鑒定結果

2.2.1BMSCs鑒定結果 流式細胞儀檢測：CD29及CD44結果表達陽性，陽性率分別為為100%、99.5%；CD34及CD45結果表達陰性，陰性率分別為98.9%、97.0%(見圖2)。對成骨誘導培養(yǎng)后BMSCs行堿性磷酸酶染色，鏡下觀察BMSCs呈現(xiàn)藍紫色(見圖3)。

圖2 骨髓間充質干細胞CD29、CD44及CD34、CD45流式檢測結果

圖3 骨髓間充質干細胞堿性磷酸酶染色(×100)

2.2.2OB鑒定結果 流式細胞儀檢測：鈣粘蛋白表達陽性，陽性率98.37%；CD45表達陰性，陰性率99.97%(見圖4)。茜素紅染色：鏡下可見紅色鈣化結節(jié)(見圖5)。

圖4 成骨細胞鈣粘蛋白、CD34流式檢測結果

圖5 成骨細胞茜素紅染色(×100)

2.2.3脂肪細胞鑒定結果 油紅O染色：鏡下見橘紅色脂肪細胞(見圖6)。

圖6 脂肪細胞油紅O染色(×100)

2.3qRT-PCR檢測miRNA-708在各組BMSCs、OB、脂肪細胞中的表達情況

2.3.1miRNA-708-3p在各組細胞中的表達

1)BMSCs：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；仙靈骨葆組對比生骨再造丸組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖7。

圖7 各組骨髓間充質干細胞中miRNA-708-3p的表達

2)OB：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；仙靈骨葆組對比生骨再造丸組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖8。

圖8 各組成骨細胞中miRNA-708-3p的表達

3)脂肪細胞：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組對比模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖9。

圖9 各組脂肪細胞中miRNA-708-3p的表達

2.3.2miRNA-708-5p在各組細胞中的表達

1)BMSCs：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；生骨再造丸組對比仙靈骨葆組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.01)，見圖10。

圖10 各組骨髓間充質干細胞中miRNA-708-5p的表達

2)OB：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；生骨再造丸組對比仙靈骨葆組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖11。

圖11 各組成骨細胞中miRNA-708-5p的表達

3)脂肪細胞：模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；仙靈骨葆組、生骨再造丸組對比模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖12。

圖12 各組脂肪細胞中miRNA-708-5p的表達

3 討論

GC導致SANFH已成為臨床共識，GC作為抗炎藥被長期應用于臨床是引起SANFH的重要原因。GC結合糖皮質激素受體(GR)可顯著影響細胞代謝、存活、增殖和分化[7]。GR介導的信號可由miRNA-708啟動子區(qū)域響應，從而引起細胞的一系列反應[8]。MicroRNA(miRNA)是一類小內源性非編碼單鏈RNA，約含有19～23個核苷酸，可與目標mRNA的非翻譯區(qū)結合，是轉錄后調控基因表達的關鍵調節(jié)因子，最新研究表明miRNA相關制劑有可能成為新的治療藥物[9]。miRNA在細胞分化、凋亡的過程中起著非常關鍵的作用。近年來，多項研究表明miRNA可調控骨代謝過程，是SANFH進展的重要因素。miRNA-708起最初被認為是一種可能的抑癌基因，miRNA-708的過表達可調節(jié)黏附分子和誘導骨髓分化，miRNA-708通過調控下游效應來影響關鍵基因，從而影響組織的自我更新及細胞的增殖、分化和死亡[10]。

Hao等[3]發(fā)現(xiàn)SANFH患者股骨頭組織中miRNA-708高表達，體外細胞實驗進一步證實GC可導致BMSCs中miRNA-708高表達。成骨分化特異性轉錄因子(RUNX2)和SMAD3可協(xié)同調節(jié)骨代謝。miRNA-708通過結合mRNA3’非翻譯區(qū)(3′-UTR)調控SMADs激活轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路，TGF-β介導SMAD3在RUNX2基因處聚集，從而抑制或激活下游靶基因可調節(jié)蛋白形成。

miRNA-708-5p和miRNA-708-3p同源于前體miRNA-708，對骨質疏松癥(OP)的發(fā)生具有協(xié)同作用。miRNA-708-5p和miRNA-708-3p在卵巢切除(OVX)大鼠和OP患者骨組織中均有高表達。miRNA-708-5p通過靶向介導SMAD特異性E3泛素蛋白連接酶-2對BMSCs的成骨細胞分化產生負調控作用，而miRNA-708-3p通過靶向結合小腦變性相關蛋白-1的翻譯RNA對骨髓單核細胞中破骨細胞的分化調控[11]。Wu等[12]在膠原誘導的大鼠RA模型中注射miRNA-708-5p可以改善RA指數(shù)，降低Wnt3a/β-catenin在大鼠關節(jié)組織中的表達。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-708-5p能誘導滑膜成纖維細胞MH7A凋亡，明顯抑制細胞集落形成和遷移、Wnt3a/β-catenin信號通路的轉錄和蛋白水平。本實驗通過LPS聯(lián)合GC成功復制SANFH的模型，發(fā)現(xiàn)模型組BMSCs和OB細胞中miRNA-708-3p和miRNA-708-5p的表達量較空白組明顯升高，表明miRNA-708-3p和miRNA-708-5p的上調參與了SANFH的發(fā)生。

生骨再造丸基于中醫(yī)整體觀念，以通陽、利濕、活血法立方，組方以淫羊藿、桂枝、黃芪、三七、澤瀉等為主。方中君藥淫羊藿、鹿角膠、骨碎補滋補肝腎，強筋骨；臣藥黃芪、桂枝補益脾肺之氣，配合利濕之澤瀉，活血化瘀之丹參、三七、龍血竭、山楂等佐使藥以通血脈，全方共奏通陽、利濕、活血之功。藥理學研究表明，淫羊藿總黃酮可抑制核因子κB(Nuclear Factor kappa-B，NF-κB)信號通路的激活從而減少促炎因子表達和炎性浸潤[13]。鹿角膠、骨碎補可補血活血、抗炎鎮(zhèn)痛，預防骨質疏松[14-15]。黃芪多糖可降低細胞因子IL-1β、IL-6的分泌，促進BMSCs的增殖分化[16]，桂枝可發(fā)揮抗炎免疫作用，促進成骨細胞增殖[17]。其余利濕活血藥物可改善股骨頭微循環(huán)和促進骨愈合的療效亦被證實。生骨再造丸治療早、中期激素性股骨頭壞死療效確切[18]，低劑量生骨再造丸可顯著改善模型大鼠的血脂水平、骨代謝水平、抑制炎癥細胞因子，改善股骨頭骨小梁密度水平及骨礦物含量，從而延緩SANFH的進展[6，19-20]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)生骨再造丸干預后SANFH中miRNA-708-3p和miRNA-708-5p的表達量明顯降低，表明生骨再造丸通過降低miRNA-708的表達以治療SANFH。

綜上所述，miRNA-708在GC誘導的股骨頭壞死中發(fā)揮著重要作用，生骨再造丸靶向下調BMSCs和OB中miRNA-708表達水平是治療SANFH的主要機制之一。但生骨再造丸進入體內代謝后通過哪種信號通路下調miRNA-708的表達水平以及miRNA-708靶向抑制哪種下游關鍵蛋白或相關信號通路，從而起到抑制SANFH的作用，還需進一步的實驗研究。