李麗秋，高 倩，顧 玲，李志輝，王 進，許 微，張雄飛，張 旭，陳美娟

(南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)約占所有肺癌病例的80%-85%，而腺癌是NSCLC最常見的類型。盡管近年腫瘤治療手段已經(jīng)取得較大進展，但由于腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等問題，肺癌患者死亡率仍高居不下[1]。

“周氏克金巖方”(來自國醫(yī)大師周仲瑛教授)為臨床抗肺癌的有效驗方，麥冬皂苷B(Ophiopogonin-B，OP-B)是從此復(fù)方中通過高通量篩選分離出來的有效單體。課題組前期研究證實OP-B可抑制NSCLC細胞增殖[2]、轉(zhuǎn)移和侵襲，誘導(dǎo)自噬和凋亡，充分顯示了OP-B多用途的優(yōu)勢。

microRNA廣泛參與腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及凋亡，對腫瘤發(fā)展具有重要意義[3]。研究發(fā)現(xiàn)，OP-B可通過Linc00668/miR-432-5p/EMT軸抑制肺癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)[4]，然而，miR-432-5p在NSCLC中的作用尚未明確，OP-B調(diào)控miR-432-5p發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機制有待進一步闡明。

1 材料與方法

1.1 材料A549、H1299、SK-MES-1和H460均購自中國科學(xué)院細胞庫/干細胞庫。麥冬皂苷-B(南京世洲生物科技, SZ20180901MDZGB)；miR-432-5p mimics和miR-NC均委托南京銳真生物技術(shù)有限公司構(gòu)建；EdU-594增殖檢測試劑盒(碧云天生物)；Transwell小室(Corning)；E-cadherin、MMP-2、Snail、β-actin一抗及羊抗兔、羊抗鼠二抗，均購自CST；miRNA第一鏈DNA合成(莖環(huán)法)、miRNA熒光定量PCR試劑盒購自生工生物；Matrigel膠(BD)；Lipofectamine 2 000(Invitrogen)。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染取1×106個A549細胞接種在6孔板中培養(yǎng)24 h，直至細胞70%-90%融合。根據(jù)Lipofectamine2000說明書轉(zhuǎn)染，實驗分為陰性對照(NC)組和miR-432-5p過表達組。

1.3 RNA提取與qRT-PCR檢測空白組不做處理，兩個實驗組分別以2.5、5 μmol·L-1OP-B處理24 h后，按照TRIzol說明書分離總RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量。引物序列見Tab 1。

Tab 1 qRT-primer sequence(5′→3′)

1.4 EdU細胞熒光染色按照EdU-594說明書操作，每組設(shè)3個復(fù)孔，染色完成后熒光顯微鏡下觀察。細胞相對增殖率/%=(EdU染色陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.5 平板克隆形成實驗每孔接種500個A549細胞于6孔板中，設(shè)3個復(fù)孔，7 d后取出，固定、染色，拍照計數(shù)。

1.6 劃痕實驗各組A549細胞長滿后，用無菌槍頭劃痕，24 h、48 h后取出拍照記錄，計算相對劃痕寬度/%=(W 24 h或W 48 h)/W 0 h×100%，實驗重復(fù)3次。

1.7 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲遷移實驗：上室加各組100 μL A549細胞無血清懸液(5×104個/孔)，下室加500 μL全培，24、48 h后固定染色；侵襲實驗鋪膠后步驟同上。

1.8 Western blot檢測細胞內(nèi)相關(guān)蛋白變化提取NC組、miR-432-5p mimics過表達組及過表達聯(lián)合OP-B 5 μmol·L-1給藥組蛋白后，進行電泳、轉(zhuǎn)膜，孵一抗、二抗，曝光后Image Lab分析條帶。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析統(tǒng)計分析采用Graphpad Prism 9.0軟件。組間差異采用t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 OP-B對不同NSCLC細胞株中miR-432-5p表達的影響qRT-PCR結(jié)果示，在5 μmol·L-1OP-B條件下，肺腺癌細胞A549中miR-432-5p表達明顯上調(diào)(P<0.01)，選取A549細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 過表達miR-432-5p抑制A549細胞增殖qRT-PCR證實mimics轉(zhuǎn)染明顯上調(diào)miR-432-5p表達(P<0.01)。EdU熒光染色和平板克隆均證實miR-432-5p抑制A549細胞增殖(P<0.01或P<0.05),結(jié)果見Tab 2。

2.3 過表達miR-432-5p抑制A549細胞遷移和侵襲劃痕實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-432-5p mimics 24 h和48 h后，與對照組相比細胞遷移水平得到顯著抑制(P<0.01)；如Tab 2示，Transwell遷移、侵襲實驗證實了上述結(jié)果(P<0.01)。

Tab 2 The effects of miR-432-5p on A549 cells proliferation, migration and invasion

2.4 OP-B調(diào)控miR-432-5p對侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達的影響miR-432-5p過表達組和過表達聯(lián)合OP-B(5 μmol·L-1)給藥組中，E-cadherin蛋白水平明顯上調(diào)，MMP-2則下調(diào)；Snail在miR-432-5p過表達后下調(diào)，聯(lián)合OP-B給藥后則更顯著下調(diào)。

3 討論

麥冬皂苷B提取自傳統(tǒng)中藥麥冬，具有明顯抗腫瘤作用。前期研究發(fā)現(xiàn) Linc00668直接靶向miR-432-5p，而OP-B則介導(dǎo)Linc00668競爭性抑制miR-432-5p，從而發(fā)揮抗NSCLC細胞轉(zhuǎn)移的作用[4]。研究表明，miR-432-5p不僅僅發(fā)揮抗腫瘤作用，還可促進腫瘤進展，然而肺癌中關(guān)于miR-432-5p的功能研究相對缺乏，OP-B調(diào)控該microRNA發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機制在很大程度上尚不清楚。本研究以肺腺癌細胞A549為實驗對象，通過EdU熒光染色和克隆形成實驗證實miR-432-5p的增殖抑制作用，劃痕和Transwell實驗則證實了其遷移、侵襲抑制作用。EMT在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[5]，通過Western blot檢測E-cadherin、MMP-2、Snail等蛋白，發(fā)現(xiàn)了miR-432-5p對EMT通路的抑制，且OP-B協(xié)同miR-432-5p的抑制效應(yīng)尤為顯著。

本研究證實了miR-432-5p抗NSCLC的作用，揭示了OP-B通過調(diào)控miR-432-5p發(fā)揮抗A549細胞增殖、遷移和侵襲的部分機制，對于其如何通過miR-432-5p作用于下游的EMT相關(guān)信號通路，及其靶點作用機制仍有待深入研究。