陳思琦，李佳欣，葛鵬玲

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種多病因的代謝性疾病，其特征是由于胰島素釋放紊亂、胰島素作用失調(diào)或兩者兼而有之造成的慢性高血糖[1]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)占糖尿病的90%以上，目前認為T2DM的主要發(fā)病機制為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，IR貫穿了2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的全過程[2-3]，同時也是高血壓、冠心病、動脈硬化、肥胖等多種疾病共同聯(lián)系的病理基礎。神經(jīng)酰胺(ceramides，Cer)是鞘脂(sphingolipid，SPL)的重要中間代謝產(chǎn)物，對鞘脂類的生物合成具有重要意義[4]。近年來研究表明[5]，神經(jīng)酰胺代謝異常參與胰島素抵抗等疾病的病理生理過程，神經(jīng)酰胺可通過抑制Akt 磷酸化從而影響胰島素信號通路，進而導致胰島素抵抗的發(fā)生。

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)IR細胞中KDSR(3-ketodihy-drosphingosine reductase，3-酮二氫鞘氨醇還原酶)基因表達上調(diào)，且通過調(diào)控神經(jīng)酰胺/PKCζ/Akt/Foxo1信號通路而引發(fā)IR?；ㄆ鞚扇适侵委?型糖尿病胰島素抵抗療效確切的臨床經(jīng)驗方，包括西洋參、澤瀉、薏苡仁三味中藥，本課題組前期已證實花旗澤仁具有明顯的改善胰島素抵抗的作用，本文以前期研究為基礎，從KDSR基因角度探討花旗澤仁改善IR的作用機制。

1 材料

1.1 HepG2細胞系HepG2人肝癌細胞株(FH0067)，購于上海中醫(yī)藥大學，保存于黑龍江中醫(yī)藥大學方劑學重點實驗室。

1.2 試劑西洋參(批號：120997)、澤瀉(批號：020001421)和薏苡仁(批號：17052009)購于河北潤和醫(yī)藥有限公司，羅格列酮(批號：122320-73-4)購于阿拉丁試劑(上海)有限公司；KDSR過表達質(zhì)粒由通用生物系統(tǒng)有限公司提供；β-actin由英國Abcam公司提供；KDSR抗體、PKCζ抗體、p-PKCζ抗體、Akt2抗體、p-Akt2抗體、Foxo1抗體、p-Foxo1抗體由美國CST公司提供；神經(jīng)酰胺C14(d18 ∶1/14 ∶0)標準品、神經(jīng)酰胺C16(d18 ∶1/16 ∶0)標準品、神經(jīng)酰胺C17標準品、神經(jīng)酰胺C18 ∶1(d18 ∶1/18 ∶1(9Z))標準品、神經(jīng)酰胺C18(d18 ∶1/18 ∶0)標準品、神經(jīng)酰胺C20(d18 ∶1/20 ∶0)標準品、神經(jīng)酰胺C24 ∶1(d18 ∶1/24 ∶1(15Z))標準品、神經(jīng)酰胺C24(d18 ∶1/24 ∶0)標準品由美國Avanti Polar Lipids公司提供；GOD-POD檢測試劑盒購于北京雷根生物有限公司。

1.3 儀器超凈工作臺(北京瀘凈凈化設備廠)；恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；生物安全柜SCB-1360(北京東聯(lián)儀器制造公司)；電泳儀(美國BIO-RAD公司)；紫外分光光度計(島津有限公司)；半干轉(zhuǎn)膜儀(美國BIO-RAD公司)；酶標儀(日本Olympus公司)；IX70倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ISO134083凍干機(美國Agilent公司)；安捷倫1290超高效液相色譜(美國Agilent公司)；安捷倫6460三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(美國Agilent公司)；正壓裝置(美國Waters公司)；渦旋儀器(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 HepG2細胞的培養(yǎng)500 mL高糖培養(yǎng)基(DEME)中加入10%胎牛血清(FBS)，以及1%青霉素-鏈霉素混合液，搖勻，4 ℃保存?zhèn)溆?。?192 ℃的液氮罐中取出細胞，迅速放入37 ℃水浴鍋中快速搖晃復蘇。加入2 mL混合好的DMEM培養(yǎng)基，以37 ℃，5% CO2的條件培養(yǎng)備用。

2.2 胰島素抵抗模型的建立根據(jù)本課題組前期對HepG2細胞胰島素抵抗(IR)模型建立條件的模索，利用高糖高胰島素處理HepG2細胞，誘導其產(chǎn)生胰島素抵抗。向配制好的高糖培養(yǎng)基中加入10-10mol·L-1胰島素，混勻，培養(yǎng)HepG2細胞48 h，使其發(fā)展成IR模型，胰島素作用時間、濃度及模型的穩(wěn)定性在本課題組前期工作中已驗證。

2.3 花旗澤仁凍干粉的制備取花旗澤仁各中藥西洋參15 g、澤瀉15 g、薏苡仁30 g，浸泡12 h，第一次加12倍水煎煮，水沸后文火煎煮60 min；第二次加8倍水煎煮，水沸后繼續(xù)用文火煎煮45 min，第三次加6倍水，水沸后文火煎煮30 min，合并三次水煎液，過濾后水浴濃縮至每毫升含生藥量1 g，采用冷凍干燥機真空冷凍干燥而成。4 ℃保存，使用前水浴加溫至37 ℃。

2.4 花旗澤仁的給藥劑量本課題組前期對花旗澤仁在HepG2胰島素抵抗細胞模型上的給藥劑量及作用時間進行摸索，得出花旗澤仁最佳給藥濃度為1/9 g·L-1，作用時間為24 h。

2.5 陽性對照藥羅格列酮的準備實驗前稱取羅格列酮粉末，加蒸餾水配制成所需濃度0.04 g·L-1的溶液。4 ℃保存，使用前取出，達到常溫后使用。

2.6 KDSR過表達質(zhì)粒的合成與轉(zhuǎn)染由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司針對人KDSR基因，根據(jù)人工構建的方式在目的基因上游加入調(diào)控元件，合成特異性KDSR基因過表達質(zhì)粒(KDSR-OE)，以腺病毒包裹，冷凍保存，同時制備未包裹過表達質(zhì)粒的腺病毒(NC)。

2.7 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術

2.7.1母液的配置 分別精密稱取神經(jīng)酰胺C14、C16、C17、C18 ∶1、C18、C20、C24 ∶1、C24標準品適量，并用異丙醇定容至1 g·L-1，所有母液均貯存在-20 ℃條件下備用。

2.7.2工作溶液的配制 將上述標準品溶液采用10%甲醇稀釋得到上述標準品溶液的濃度：C14、C24 ∶1和C24為6.25 mg·L-1；C16和C18 ∶1為 3.125 mg·L-1；C18和C20為12.5 mg·L-1。內(nèi)標(C17)由蛋白沉淀劑配置而成，濃度為 100 μg·L-1。

2.7.3標準曲線和質(zhì)控樣本溶液的配制 利用上述工作溶液與0.5×PBS 溶液(模擬基質(zhì))配制標準曲線溶液，標準曲線溶液為七個等級，各個物質(zhì)的標準曲線濃度范圍在本課題組前期實驗中已完成測定。質(zhì)控樣本在分析前新鮮配制，分為低、中、高三個等級，每個等級分別對應標準曲線的第2、4、6濃度點。

2.7.4色譜與質(zhì)譜條件 有機相和水相中同時加入0.2%的甲酸以保證洗脫系統(tǒng)中pH值恒定。神經(jīng)酰胺C17作為內(nèi)標：流動相為含有0.2%甲酸的甲醇和0.2%甲酸的水相，流速為0.3 mL·min-1，柱溫設置在30 ℃。所選質(zhì)譜柱為 waters Xbrige BEH C18(2.1×50 mm,2.5 μm)。分別精密稱取神經(jīng)酰胺C14，C16，C17，C18 ∶1，C18，C20，C24 ∶1，C24標準品適量，并用異丙醇定容至 1 g·L-1，所有母液均貯存在-20 ℃條件下備用。

液相洗脫梯度如Tab 1所示。

Tab 1 Liquid phase conditions of HPLC-MS/MS

采用電噴霧離子化源，干燥氣溫度為350 ℃，鞘流氣溫度為325 ℃，采用多反應監(jiān)測(MRM)模式對待分析化合物進行監(jiān)測。具體MS參數(shù)如Tab 2所示。

Tab 2 Mass spectrum conditions

2.7.5樣品處理 將研究樣品(100 μL)轉(zhuǎn)移到EP管中。向每個管中添加蛋白質(zhì)沉淀溶液(400 μL)，蛋白沉淀劑為異丙醇-氯仿(9 ∶1)，渦旋振蕩3 min，以3 000×g離心10 min，然后將250 μL上清液轉(zhuǎn)移到干凈的進樣小瓶中，并進行LC-MS/MS分析。本研究采用0.5×PBS的作為空白樣品作為對照，排除基質(zhì)的干擾。

2.7.6方法專屬性 分別配制空白溶液、標準品溶液、待測樣品，同“樣品處理”方法操作后，進樣分析，對比空白溶液、含有混合對照品的腸菌液和待測樣品色譜圖。觀察待測組分和內(nèi)標物的出峰位置。

2.7.7標準曲線的制備 在本研究中，標準曲線包括7個水平，標準曲線樣本經(jīng)過樣本前處理方法處理分析后，以待分析化合物的質(zhì)譜相應值與對應內(nèi)標的質(zhì)譜響應值的比值為因變量，以待測化合物的濃度為自變量進行分析。標準曲線在本課題組前期工作中已完成測定。

2.7.8精密度和準確度的測定 取3個濃度的QC樣本，經(jīng)過樣本前處理后進樣分析，并連續(xù)3 d平行配制，進樣后通過標準曲線計算濃度。計算每日(日內(nèi))和3 d(日間)樣本的測定結果精密度，以變異系數(shù)(CV)表示，應小于15%；準確度通過真實值和標示量的差異進行計算，以相對誤差表示(RE)，應小于±15%。

2.7.9提取回收率和基質(zhì)效應 配制低、中、高濃度的質(zhì)控樣本，經(jīng)過既定的前處理方法進行處理，經(jīng)過進樣分析得到待測化合物的響應值為A；取空白0.5×PBS樣本進行前處理，加入標準品水溶液制備和QC樣本濃度一致的溶液，進樣分析，得到待測化合物的響應值B；取標準品水溶液，制備和QC樣本濃度相同的溶液，進樣分析，得到待測化合物的響應值C，A與B的比值即為提取回收率，B與C的比值為基質(zhì)效應。

2.7.10樣品檢測 分別取各組樣品，按“2.7.5樣品處理”方法制備供試品溶液，依照上述方法進行檢測，記錄各色譜峰面積，代入標準曲線，計算樣品各成分的含量。

2.8 實時熒光定量PCR傾倒培養(yǎng)液，加入PBS溶液洗滌細胞，滴加Trizol溶液反復吹打，室溫放置5 min；離心取上層清液并轉(zhuǎn)移至離心管，加入氯仿溶液，渦旋振蕩，常溫放置5 min；12 000×g離心15 min。將上層透明水相取出滴加異丙醇混勻，室溫靜置；離心去上清液，加入70%乙醇渦旋混勻，離心棄上清，室溫下干燥10 min；滴入失活水溶解，-80 ℃低溫存放。根據(jù)試劑盒說明書所述步驟進行試驗。

2.9 蛋白印跡法洗滌細胞后加入細胞裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF+10 μL蛋白酶抑制劑+10 μL磷酸酶抑制劑)使細胞充分裂解；4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min；配制分離膠及濃縮膠，用微量進樣器加待測樣品及Maker；以電壓80 V開始電泳；電泳結束后，取出凝膠放入轉(zhuǎn)膜液中，將準備好的PVDF膜先放入甲醇中30 s，后轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)膜液中，恒流轉(zhuǎn)膜45-50 min；放入裝有適量的5%牛奶封閉液的平皿中封閉1 h；洗膜3次；分別將一抗，即KDSR抗體、PKCζ抗體、p-PKCζ抗體、Akt2抗體、p-Akt2抗體、Foxo1抗體以及p-Foxo1抗體用TBST稀釋比例為1 ∶1 000，將PVDF膜放入一抗中4 ℃過夜；洗膜3次；將二抗用TBST稀釋比例為1 ∶5 000，將PVDF膜放入二抗中37 ℃，孵育1 h；洗膜3次；顯影拍照。

2.10 葡萄糖檢測試劑盒配置好GOD-POD工作液，將標準品按梯度依次稀釋到2.5，1.25，0.625，0.3 125，0.15 625 mmol/L。取上述各組處理后的細胞適量(>106)，離心保留細胞沉淀，加入200 μL 1% Triton X-100冰上裂解30 min。設立空白組，標準組和樣品組，統(tǒng)一加入300 μL GOD-POD工作液，空白孔加入dd H2O，標準組分別加入上一步配置好的標準品，樣品組加入需測定的樣品，充分混勻，37 ℃孵育15 min。用酶標儀測定505 nm處的吸光度(OD值)，以空白孔調(diào)零，讀取標準組，樣品組的吸光度，根據(jù)標準組繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品組的樣品濃度，再根據(jù)葡萄糖含量換算公式計算葡萄糖含量。

3 結果

3.1 花旗澤仁對KDSR基因及蛋白表達的影響

3.1.1花旗澤仁可降低KDSR mRNA的高表達 qRT-PCR實驗結果如Fig 1所示，與對照組相比，IR細胞中KDSR mRNA表達較高，與IR組相比，給予花旗澤仁后IR細胞中KDSR表達明顯下降，差異具有顯著性(P<0.01)；于正常HepG2細胞中過表達KDSR(KDSR-OE)后給予花旗澤仁，與KDSR-OE組相比，KDSR表達也存在一定程度的下降，差異具有顯著性(P<0.01)。綜上，花旗澤仁可降低KDSR基因的高表達。

Fig 1 Effect of Huaqizeren on KDSR mRNA expression

3.1.2花旗澤仁可降低KDSR 蛋白的高表達 結果如Fig 2(A、B)所示，與對照組相比，IR細胞中KDSR蛋白表達上調(diào)，與IR組相比，給予花旗澤仁后IR細胞中KDSR蛋白表達有所下降，差異具有顯著性(P<0.01)；轉(zhuǎn)染KDSR-OE的正常HepG2細胞中KDSR蛋白上調(diào)，給予花旗澤仁后KDSR蛋白表達量有所下降，差異具有顯著性(P<0.01)，故花旗澤仁可降低KDSR蛋白的高表達。

Fig 2 Effect of Huaqizeren on KDSR protein expression

3.2 花旗澤仁對細胞神經(jīng)酰胺含量的影響利用HPLC-MS/MS技術檢測各組神經(jīng)酰胺各單體及總神經(jīng)酰胺含量，結果如Tab 3、Fig 3所示，與IR組相比，給藥花旗澤仁后細胞總神經(jīng)酰胺含量明顯下降，且與空白組接近，差異具有顯著性(P<0.01)；而當KDSR-OE組給予花旗澤仁后，細胞神經(jīng)酰胺含量也有一定程度下降，且差異具有顯著性(P<0.01)。故花旗澤仁可降低IR細胞中神經(jīng)酰胺含量。

Tab 3 Contents of ceramide in different samples(μg·L-1)

Fig 3 Total ceramide content in cells of each group

3.3 花旗澤仁對神經(jīng)酰胺通路PKCζ/Akt/Foxo1的影響Western blot結果顯示，如Fig 4、5、6(A、B)所示，與對照組相比，IR細胞中PKCζ磷酸化水平上調(diào)、Akt2磷酸化水平下降、Foxo1磷酸化水平上升，差異具有顯著性(P<0.01)；與IR組相比，給藥花旗澤仁后PKCζ磷酸化水平下降、Akt2磷酸化水平上升、Foxo1磷酸化水平下降，差異具有顯著性(P<0.01)；與對照組相比，正常HepG2細胞中轉(zhuǎn)染KDSR-OE后PKCζ磷酸化水平上調(diào)、Akt2磷酸化水平下降、Foxo1磷酸化水平上升，差異具有顯著性(P<0.01)；轉(zhuǎn)染KDSR-OE后給予花旗澤仁，PKCζ磷酸化水平下降、Akt2磷酸化水平上升、Foxo1磷酸化水平下降，差異具有顯著性(P<0.01)。故花旗澤仁可改善IR細胞中神經(jīng)酰胺通路PKCζ/Akt/Foxo1過度激活的狀態(tài)。

Fig 4 Effect of Huaqizeren on PKC zeta phosphorylation level

Fig 5 Effect of Huaqizeren on AKT2 phosphorylation level

Fig 6 Effect of Huaqizeren on FoxO1 phosphorylation

3.4 花旗澤仁對細胞葡萄糖消耗的影響我們采用花旗澤仁濃度為1/9 g·L-1進行給藥，并以0.04 g·L-1羅格列酮作為陽性對照藥，檢測細胞葡萄糖含量。結果如Fig 7所示，與對照組相比，IR細胞中葡萄糖含量明顯升高，差異具有顯著性意義(P<0.01)；與IR組相比，給藥花旗澤仁后IR細胞葡萄糖含量明顯下降，且與空白組接近，差異具有顯著性意義(P<0.01)；根據(jù)本課題組前期研究所得結果可知，KDSR-OE可提高細胞葡萄糖含量至IR程度，而當KDSR-OE組給予花旗澤仁后，細胞葡萄糖含量也有一定程度下降，且差異具有顯著性意義(P<0.01)。故花旗澤仁可在一定程度上降低IR細胞中葡萄糖含量，改善細胞胰島素抵抗狀態(tài)。

Fig 7 Effect of Huaqizeren on cell glucose content

4 討論

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病的病理基礎和主要特征，也是高血壓、高脂血癥、冠心病等疾病的主要病因[7]。研究表明[8]，多種中藥及其有效成分通過減弱IR在治療2型糖尿病中發(fā)揮重要作用，已成為近年來防治IR的研究熱點。中藥復方花旗澤仁為臨床治療2型糖尿病IR的有效經(jīng)驗方，其治療病癥明確，藥物療效確切，主要活性成分相對清楚。本方基于中醫(yī)藥整體觀念和辨證論治的理論，從2型糖尿病IR脾虛濕盛，濕熱內(nèi)蘊的病理特點出發(fā)，以補氣養(yǎng)陰、清火生津之功的西洋參為君藥，滲濕健脾的薏苡仁為臣藥，利水滲濕、泄熱之澤瀉為佐藥，配伍組成花旗澤仁中藥復方，共奏補氣、健脾、生津、清熱、利濕之功。本課題基于中醫(yī)藥對IR的防治作用，探討花旗澤仁改善IR的作用機制。

本課題組前期已進行了花旗澤仁的成藥性研究，其中包括確定花旗澤仁(西洋參、澤瀉、薏苡仁)的最佳藥量配比；完成體內(nèi)實驗的相關藥效學指標和體外實驗的相關藥效學指標[9]；確定花旗澤仁藥代動力學特征；明確腸道菌群對花旗澤仁的影響[10-11]；完成安全性早期評價實驗；在體內(nèi)研究中我們發(fā)現(xiàn)，花旗澤仁可明顯降低胰島素抵抗大鼠的空腹血糖，使其胰島素敏感性升高；在體外研究中，我們也證實了花旗澤仁具有改善肝臟、脂肪、骨骼肌細胞胰島素抵抗的作用[12-14]，但其作用機制仍需進一步探究。

在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)，花旗澤仁對IR關鍵信號分子Akt的活性具有一定影響，而我們前期篩選的KDSR基因?qū)kt上游信號分子神經(jīng)酰胺具有一定的調(diào)控作用，并通過神經(jīng)酰胺下游PKCζ/Akt/Foxo1信號通路參與IR的發(fā)生。本課題組前期研究已證實，IR細胞中KDSR基因的表達水平升高、神經(jīng)酰胺含量明顯提高、神經(jīng)酰胺下游PKCζ/Akt/Foxo1信號通路活化程度異常，且細胞中葡萄糖含量較高，而抑制IR細胞中KDSR基因的表達可降低神經(jīng)酰胺含量、減少PKCζ/Akt/Foxo1信號通路表達異常的狀態(tài)，同時細胞的葡萄糖含量有所下降；當正常HepG2細胞中KDSR基因過表達時，可使正常HepG2細胞中神經(jīng)酰胺含量升高、PKCζ/Akt/Foxo1信號通路活化程度異常，同時也使正常HepG2細胞產(chǎn)生與IR細胞類似的葡萄糖含量升高的情況。這表明，KDSR基因的高表達通過提高神經(jīng)酰胺含量并調(diào)節(jié)其下游PKCζ/Akt/Foxo1信號通路參與IR的發(fā)生，這可能是IR發(fā)生的機制之一?；诖私Y論，我們探究花旗澤仁是否通過調(diào)節(jié)KDSR基因的表達改善IR。

本部分實驗對IR細胞給藥花旗澤仁，同時對正常HepG2細胞進行KDSR基因過表達實驗，轉(zhuǎn)染KDSR過表達質(zhì)粒(KDSR-OE)，并給予花旗澤仁處理，觀察這兩種細胞KDSR基因表達情況、神經(jīng)酰胺含量、PKCζ/Akt/Foxo1信號通路活性及葡萄糖含量，深入探討花旗澤仁改善IR的作用機制。結果顯示，給藥花旗澤仁后，IR細胞及KDSR過表達細胞中KDSR的表達水平明顯下降，神經(jīng)酰胺含量降低，且PKCζ/Akt/Foxo1信號通路表達異常的狀態(tài)有所改善，同時，給藥后兩種細胞中葡萄糖含量明顯下降。

綜上所述，花旗澤仁改善IR的作用機制之一可能是通過下調(diào)IR細胞中KDSR基因的表達，降低IR細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的含量，調(diào)節(jié)PKCζ/Akt/Foxo1信號通路的活化狀態(tài)，進而改善IR。