崔欣欣，白曉潔，王起越，李俊虎，曹茜倩，林媛媛，封啟龍

(1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生理學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001;2.太原市衛(wèi)生學(xué)校臨床教研室，山西 太原 030012;3.山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 山西白求恩醫(yī)院心血管內(nèi)科，山西 太原 030032)

病理性心肌肥厚是由高血壓、心律失常等多種原因引起的心臟組織結(jié)構(gòu)的異常改變，如未給予及時(shí)有效的干預(yù)將最終發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的心力衰竭[1]。然而，目前對(duì)心肌肥厚尚缺乏有效干預(yù)措施，許多臨床使用的藥物也僅限于在一定程度上緩解癥狀，因此，如何對(duì)心肌肥厚進(jìn)行有效干預(yù)，仍是臨床亟需解決的熱點(diǎn)問(wèn)題。天然化合物姜黃素(curcumin)對(duì)多種心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、心律失常、心力衰竭等均表現(xiàn)出顯著的心血管保護(hù)效應(yīng)，對(duì)心肌肥厚也具有一定的心臟保護(hù)作用，但其對(duì)循環(huán)微顆粒的影響尚未完全闡明[2-5]。近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞微顆粒(microparticles，MPs)在多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[6]。MPs是細(xì)胞受刺激后從細(xì)胞表面脫落的直徑0.1-1 μm的細(xì)胞外囊泡，其內(nèi)容物所包含的mRNA、蛋白質(zhì)、微小核糖核酸等物質(zhì)在細(xì)胞間信息傳遞過(guò)程中具有非常重要的作用[7]。MPs在健康人循環(huán)血液中就有少量存在，在病理狀態(tài)下如心肌肥厚、冠狀動(dòng)脈疾病、腫瘤等疾病中含量則明顯升高。目前認(rèn)為，MPs具有促進(jìn)凝血反應(yīng)、血栓形成、炎癥反應(yīng)、上調(diào)血管張力、促進(jìn)血管生成等多種作用，并參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展[8]，但其在心肌肥厚大鼠體內(nèi)的改變及其確切作用尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)利用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)(abdominal aortic constriction，AAC)建立心肌肥厚大鼠模型，用姜黃素干預(yù)4周后觀察其對(duì)大鼠心臟功能的影響，同時(shí)檢測(cè)了各組大鼠循環(huán)血液中的微顆粒水平。探討姜黃素的心臟保護(hù)作用是否與微顆粒有關(guān)，進(jìn)一步觀察了MPs對(duì)體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物和細(xì)胞株 SPF級(jí)健康SD ♂大鼠，體質(zhì)量為(180-200)g，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(晉)2015-0001；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2試劑 姜黃素購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；DMEM低糖細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、CCK-8試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清購(gòu)自CellMax公司。

1.1.3器械 臺(tái)式低速離心機(jī)(SC-3612)購(gòu)自安徽中佳科學(xué)儀器有限公司；高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；超級(jí)恒溫水浴箱、BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟科技有限公司；M模式超聲系統(tǒng)(Vivid 7)購(gòu)于美國(guó)GE Healthcare公司；酶標(biāo)儀(SMP6)購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1模型制備及動(dòng)物分組 采用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠模型。大鼠麻醉備皮后，沿腹正中線切開(kāi)皮膚，鈍性分離皮下肌層，在腎動(dòng)脈分叉處上方約1 cm游離腹主動(dòng)脈，用4-0結(jié)扎線同時(shí)結(jié)扎墊扎針和腹主動(dòng)脈，抽出墊扎針，抗菌處理后關(guān)閉腹腔。Sham組大鼠(n=10),只穿線不結(jié)扎，其余步驟相同。16周后超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)手術(shù)大鼠心功能，達(dá)到心肌肥厚標(biāo)準(zhǔn)的大鼠隨機(jī)分為AAC組(n=10，每日給予等量生理鹽水灌胃處理，持續(xù)4周)；姜黃素組(n=10，每日按100 mg·kg-1劑量給予姜黃素灌胃，持續(xù)四周)。每組10只大鼠中隨機(jī)抽取6只進(jìn)行超聲和血壓檢測(cè)，4只用于左心室血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。動(dòng)物發(fā)生死亡則補(bǔ)足至10只。

1.2.2超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能 10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，待肌肉松弛后行心前區(qū)備皮進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。觀察指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)以及左室后壁厚度(LVPWd)。

1.2.3心率及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 25%烏拉坦(4 mL·kg-1)麻醉大鼠，將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，四肢連接上心電圖導(dǎo)聯(lián)線記錄心率(HR)變化；頸部備皮后沿頸正中線切開(kāi)皮膚，鈍性分離皮下肌層，暴露右頸總動(dòng)脈，穿線結(jié)扎遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈夾夾閉近心端，穿線備用，使用眼科剪在右頸總動(dòng)脈中上1/3處剪一小口，插入充滿含肝素生理鹽水的動(dòng)脈插管，固定并結(jié)扎，待出現(xiàn)血壓波穩(wěn)定10 min后記錄大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP);緩緩?fù)苿?dòng)插管至左心室，記錄以下血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室內(nèi)壓力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.2.4血漿樣本制備及提取微顆粒 參考文獻(xiàn)[9]，從左側(cè)頸總動(dòng)脈收集血液于含3.8%枸櫞酸鈉采血管中，1 550×g離心20 min取上層乏血小板血漿(platelet-free plasma，PFP)，將PFP 15 000×g再離心45 min,棄上清，PBS液吹打沉淀得MPs懸液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5循環(huán)MPs蛋白含量檢測(cè) 嚴(yán)格按照BCA試劑盒說(shuō)明配制標(biāo)準(zhǔn)品與工作液，取各組MPs加入工作液，每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

1.2.6循環(huán)MPs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響 取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)，以2.5×104的密度鋪96孔板，貼壁后將Sham組、AAC組和姜黃素組微顆粒以100 m g·L-1的濃度加入培養(yǎng)基，Control組加入等量PBS，孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK-8檢測(cè)試劑，1 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，按公式計(jì)算存活率。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況和存活率實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，與Sham組相比，AAC組大鼠毛發(fā)干燥發(fā)黃、飲食、飲水量及活動(dòng)度下降，姜黃素組大鼠的上述表現(xiàn)明顯改善。Sham組與姜黃素組大鼠無(wú)死亡，存活率為100%，AAC組大鼠在給藥開(kāi)始后d 6和d 25各死亡1只，存活率為80%(Fig 1)。

2.2 超聲心動(dòng)圖心功能測(cè)定與Sham組相比，AAC組LVIDd從(5.05±0.24)mm升高到(7.44±0.52)mm(P<0.01)，LVIDs從(2.01±0.22)mm升高到(4.02±0.47)mm(P<0.01)、LVPWd從(2.17±0.10)mm升高到(2.66±0.16)mm(P<0.05)，EF從93.00%±1.35%下降至80.00%±4.49%(P<0.05)、FS從60.50%±2.53%下降至46.38%±4.90%(P<0.05)，表明造模成功。使用姜黃素(圖中簡(jiǎn)稱Cur)后，上述指標(biāo)均有明顯改善，其中LVIDd、LVIDs和LVPWd分別下降至(6.09±0.22)mm(P<0.05)、(2.38±0.17)mm(P<0.01)、(2.20±0.10)mm(P<0.05)；EF以及FS分別升高至92.88%±0.95%(P<0.01)，61%±1.80%(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 1 Kaplan-Meier survival curves for rats with pressure overload-induced hypertrophy

2.3 動(dòng)脈壓與心率術(shù)后20周，與Sham組相比，AAC組大鼠MAP較Sham組升高明顯(139.84±6.76)vs(88.89±12.42)mmHg，(P<0.01)，姜黃素治療后，MAP明顯降低(117.08±5.57)mmHg，(P<0.05)(Fig 3B、C)。AAC組大鼠HR增加(401±26vs233±8)，(P<0.01)，如Fig 3A所示，使用姜黃素后，心率有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(Fig 3D)。

Fig 2 Assessment of global cardiac function using echocardiography in rats with pressure overload-induced hypertrophy 4 wks after treatment

Fig 3 Measurement of heart rate and blood pressure in rats with pressure-overload hypertrophy

Fig 4 Results of hemodynamics after treatment in rats with pressure overload-induced hypertrophy

2.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)術(shù)后20周，AAC組大鼠LVSP較Sham組顯著下降(100.22±8.95vs159.51±2.56 mmHg，P<0.01)，+dp/dtmax(4.11±0.46vs8.40±0.31 mmHg/ms)和-dp/dtmax(3.39±0.37vs6.95±0.47 mmHg/ms)均明顯下降(P<0.01)，LVEDP明顯升高(4.55±1.05vs-11.63±1.90 mmHg，P<0.05)，心臟收縮和舒張功能出現(xiàn)障礙。姜黃素組大鼠的上述指標(biāo)LVSP(142.02±5.30 mmHg，P<0.01)、LVEDP(-5.34±1.65 mmHg，P<0.05)、+dp/dtmax(6.56±0.63 mmHg/ms，P<0.01)以及-dp/dtmax(5.12±0.56 mmHg/ms，P<0.05)均得到明顯改善(Fig 4A-D)。

2.5 循環(huán)MPs蛋白含量測(cè)定利用BCA試劑盒進(jìn)行循環(huán)血MPs蛋白含量測(cè)定。結(jié)果顯示，AAC組大鼠血液中混合微顆粒蛋白含量較Sham組明顯升高(371.43±5.62)vs(120.8±3.44)mg·L-1(P<0.01)，姜黃素干預(yù)后，微顆粒蛋白含量明顯降低(245.05±3.80)mg·L-1(P<0.01)(Fig 5)。

2.6 微顆粒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活能力的影響將對(duì)照組的HUVEC存活率設(shè)為100%，細(xì)胞存活率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與Sham組大鼠循環(huán)血MPs共孵育的HUVEC存活率為(98.88%±4.30%)，AAC組存活率明顯下降(80.18%±6.17%，P<0.05)，姜黃素組微顆粒共孵育的HUVEC的存活率明顯升高(93.61%±2.26%，P<0.05)(Fig 6)。

Fig 5 Results of different groups of protein concentration

Fig 6 Cell survival rate of HUVECs treated with rat circulating microparticles

3 討論

循環(huán)微顆粒與多種心血管等疾病的發(fā)生發(fā)展均具有密切關(guān)系。一方面，在冠狀動(dòng)脈疾病、心力衰竭、高血壓、心律失常、動(dòng)脈粥樣硬化、高血脂等多種疾病或病理情況下，均發(fā)現(xiàn)有血中微顆粒的明顯升高[10]，提示含量改變有可能作為臨床凝血異常、炎癥狀態(tài)和血管功能障礙的疾病標(biāo)志物[11-12]。Mallat等[13]也報(bào)道有冠心病家族史健康個(gè)體的內(nèi)皮MPs水平明顯高于無(wú)冠心病家族史的健康個(gè)體，急性冠脈綜合征患者的循環(huán)血液中存在高含量的促凝性內(nèi)皮MPs，可能是冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓產(chǎn)生和存在的重要因素之一。另一方面，升高的MPs也主動(dòng)參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程[14-15]，且其升高程度往往與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[16]。

前期本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，大鼠心力衰竭后微顆粒水平明顯升高，且對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移具有明顯抑制作用[17]。眾所周知，內(nèi)皮細(xì)胞作為血管系統(tǒng)的重要成分，其功能的改變與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，心肌肥厚大鼠血液中微顆粒水平亦表現(xiàn)為明顯升高。那么，升高的微顆粒是否與心肌肥厚有關(guān)？通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MPs與HUVEC共孵育后，可明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，提示MPs直接參與了血管內(nèi)皮的損傷。

姜黃素是從姜黃中提取的一種黃色多酚類化合物，近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明姜黃素具有顯著的心臟保護(hù)作用[2-5]。本研究利用縮窄腹主動(dòng)脈建立大鼠慢性心肌肥厚模型，觀察了姜黃素對(duì)慢性心肌肥厚的影響。結(jié)果顯示，姜黃素可以明顯提高模型大鼠存活率，降低MAP，改善LVIDs、LVIDd和LVPWd，提高EF與FS，同時(shí)使LVSP升高、LVEDP降低，證實(shí)姜黃素具有明顯的心臟保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)姜黃素干預(yù)后，肥厚大鼠循環(huán)MPs水平明顯下降，且可顯著提高體外實(shí)驗(yàn)中HUVEC的存活率。

綜上所述，姜黃素對(duì)壓力超負(fù)荷型心肌肥厚具有顯著的心臟保護(hù)效應(yīng)，這一作用與姜黃素有效降低循環(huán)血中MPs水平，提高內(nèi)皮存活率有關(guān)。關(guān)于MPs確切的有效成分，尚有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。