袁曉麗 1，江莉 1，黃莉莉 1，胡斌

(1.綿陽(yáng)市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川綿陽(yáng) 621000;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川瀘州 646000)

新生血管形成是腫瘤疾病發(fā)生及發(fā)展的重要過(guò)程，其不僅使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，還能參與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程[1]。腫瘤生長(zhǎng)需要血管內(nèi)皮細(xì)胞的旁分泌作用，而人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)是一種重要的內(nèi)皮細(xì)胞[2]。探究HUVEC的增殖、運(yùn)動(dòng)是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，研究顯示micro RNA可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[3]。miR-154-3p是近年來(lái)研究較多的一種micro RNA，Jiang等[4]研究表明，降低miR-154-3p的表達(dá)水平會(huì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。Fan等[5]研究表明，過(guò)表達(dá)miR-154-3p可以抑制甲狀腺癌的發(fā)展。近年來(lái)隨著對(duì)腫瘤研究的深入，發(fā)現(xiàn)除了micro RNA，Smad蛋白也介導(dǎo)了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程。Troncone等[6]研究表明，Smad7在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)也被上調(diào)，為促癌因子。李勇等[7]研究表明，miR-181c靶向作用Smad7調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生物學(xué)特性。因此推測(cè)miR-154-3p也可以靶向調(diào)控Smad7對(duì)HUVEC的相關(guān)生物學(xué)特征有一定的影響，但目前尚無(wú)有關(guān)研究。本研究探究了miR-154-3p和Smad7的靶向性，同時(shí)分析了miR-154-3p作用后的HUVEC的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)及免疫的機(jī)制機(jī)理，旨在為相關(guān)癌癥的臨床診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞

HUVEC細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 主要試劑與儀器

TRAIL購(gòu)自英國(guó)Pepro Tech公司；Lipo‐fectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；胰蛋白酶購(gòu)自Biosharp公司；青霉素和鏈霉素購(gòu)自Solarbio公司；TRAIL購(gòu)自英國(guó)Pepro Tech公司；胎牛血清購(gòu)自Hyelone公司；孔板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；VEGF抗體（貨號(hào)：sc-7269）、Smad7抗體（貨號(hào)：sc-365846）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS）、白細(xì)胞介素-6(interleu‐kin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)均購(gòu)自武漢華聯(lián)科有限公司。

Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning Coseter公司；Cubis型模塊化電子天平購(gòu)自蘇州賽多斯有限公司；SF-TGL-20R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海菲恰爾分析儀器有限公司；WMJ-9688型正置金相顯微鏡購(gòu)自上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司；L00816C型快速智能蛋白印跡儀、L00686C型快速智能蛋白濕轉(zhuǎn)儀、L00657C型快速智能蛋白染脫色儀均購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；Leica VT1200型震蕩切片機(jī)、CM3050S型冰凍切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇HUVEC細(xì)胞，分散于包含100 U/mL的青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，進(jìn)行傳代培，養(yǎng)。

1.3.2 分組 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)HUVEC細(xì)胞，分為：Control組、miR-154-3p組、Smad7組和miR-154-3p+Smad7組。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建 miR-154-3p組：將miR-154-3p mimic轉(zhuǎn)染HUVEC；Smad7組：使用pcDNA3.0構(gòu)建Smad7過(guò)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染HU‐VEC；miR-154-3p+Smad7組：將miR-154-3p mimic和Smad7過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞，根據(jù)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)際Lipofectamine 2000說(shuō)明進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染后24 h，篩選穩(wěn)定的細(xì)胞株，Control組僅加入轉(zhuǎn)染試劑。

1.3.4 RT-PCR檢測(cè)miR-154-3p和Smad7的mRNA表達(dá)水平 取上述各組HUVEC細(xì)胞，采用Trizol提取細(xì)胞總RNA，選用兩步法RNA提取試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。選擇miR-154-3p和Smad7的合適上下游引物，以cDNA為模板采用定量PCR儀擴(kuò)增，以actin為內(nèi)參照基因采用2?△△Ct法計(jì)算miR-154-3p和Smad7的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶向性 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)，采用生物學(xué)預(yù)測(cè)miR-154-3p和Smad7的靶點(diǎn)，miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件提示，miR-154-3p的可能結(jié)合位點(diǎn)為Smad7 mRNA的3’UTR位點(diǎn)176～182，體外合成含該位點(diǎn)的DNA片段（wt）以及含該位點(diǎn)突變體（mut）的DNA片段，退火后克隆到雙熒光素酶啟動(dòng)子載體。將miR-154-3p質(zhì)粒和Smad7 mRNA分別單獨(dú)和共轉(zhuǎn)染卵HUVEC細(xì)胞，孵育48 h后，用熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性，并統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Smad7和VEGF表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)期上述各組HUVEC細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，定量后經(jīng)10%SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，使用脫脂奶粉封閉2 h，完成封閉后加入Smad7抗體（稀釋比例1∶500）和VEGF抗體（稀釋比例1∶500），孵育24 h后TBST緩沖液洗滌3次，加入二抗，孵育1 h后TBST緩沖液洗滌3次，ECL顯影劑顯影，以GADPH為內(nèi)參蛋白，計(jì)算Smad7和VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期上述各組HUVEC細(xì)胞，制作成濃度為1×105/mL單細(xì)胞懸液，接種于6孔板，100個(gè)/孔，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，2周觀察細(xì)胞克隆形成情況，加入結(jié)晶紫染液染色30 min后拍照。

1.3.8 微管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期上述各組HUVEC細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整濃度至1.2×105/mL后接種于Matrigel人工基質(zhì)膠與4℃預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶1比例混合，接種于24孔板中，1 mL/孔，進(jìn)行孵育，共16 h，每4 h采用光學(xué)顯微鏡（400×）隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察微管樣結(jié)構(gòu)形成情況并拍照計(jì)數(shù)。

1.3.9 iNOS、IL-6和IL-10水平 取對(duì)數(shù)期上述各組HUVEC細(xì)胞，制作1×103個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，使用細(xì)胞裂解液裂解后，按照iNOS、IL-6和IL-4試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)iNOS、IL-6和IL-4含量水平。

1.3.10 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況 取對(duì)數(shù)期上述各組HUVEC細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，100μL基質(zhì)膠均勻覆蓋于Transwell小室底部，上室加入100μL細(xì)胞懸液，下室加入等量含血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，對(duì)侵襲至下室的HUVEC細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，隨機(jī)選取各組細(xì)胞55個(gè)高倍鏡視野，拍照并計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism5軟件作圖，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-154-3p和Smad7靶向性檢測(cè)

根據(jù)NCBI上查詢(xún)miR-154-3p上有Smad7的結(jié)合位點(diǎn)；采用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比Control組，minic-NC組miR-154-3p和Smad7 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；相比Control組，miR-154-3p組miR-154-3p表達(dá)顯著升高，Smad7 mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05）；野生型miR-154-3p組熒光酶活性顯著低于突變體miR-154-3p組熒光酶活性（P<0.05），表明miR-154-3p上有Smad7的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 miR-154-3p和Smad7靶向性檢測(cè)Figure 1 Targeted detection of miR-154-3p and Smad7

2.2 各組Smad7表達(dá)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Smad7表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，pc-DNA組Smad7表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；相比Control組，Smad7組Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)顯著升高（P<0.05）。相比Control組，miR-154-3p組miR-154-3p相對(duì)表達(dá)顯著升高（P<0.05），Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)和細(xì)胞克隆形成率顯著降低（P<0.05）；相比Control組，Smad7組miR-154-3p相對(duì)表達(dá)顯著降低（P<0.05），Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)和細(xì)胞克隆形成率顯著升高（P<0.05）；相比Smad7組，miR-154-3p+Smad7組miR-154-3p相對(duì)表達(dá)顯著升高（P<0.05），Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)和細(xì)胞克隆形成率顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組Smad7表達(dá)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 2 Expression and clone formation of Smad7 in each group

2.3 細(xì)胞侵襲狀況檢測(cè)結(jié)果

Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比Control組，miR-154-3p組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)顯著降低，Smad7組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)顯著升高（P<0.05）；相比Smad7組，miR-154-3p+Smad7組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞侵襲狀況檢測(cè)結(jié)果Figure 3 Detection of cell invasion

2.4 各組VEGF表達(dá)及微管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比Control組，miR-154-3p組VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平和微管形成節(jié)點(diǎn)數(shù)均顯著降低，Smad7組VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平和微管形成節(jié)點(diǎn)數(shù)均顯著升高（P<0.05）；相比Smad7組，miR-154-3p+Smad7組VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平和微管形成節(jié)點(diǎn)數(shù)均顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 各組VEGF表達(dá)及微管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Figure 4 VEGFexpression and microtubule formation in each group

2.5 各組相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平

RT-PCR和ELISA法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子水平發(fā)現(xiàn)，相比Control組，miR-154-3p組iNOS mRNA和血清iNOS含量水平以及IL-6 mRNA和血清IL-6含量水平顯著降低，IL-10 mRNA和血清IL-10含量水平顯著升高（P<0.05）；相比Smad7組，miR-154-3p+Smad7組iNOS mRNA和血清iNOS含量水平以及IL-6 mRNA和血清IL-6含量水平顯著升高，IL-10 mRNA和血清IL-10含量水平顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 各組相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平Figure 5 Expression of cytokine levels in each group

3 討論

Smad7是Smads家族中抑制型Smads，可以通過(guò)TGF-β作用細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，同時(shí)抑制TGF-β下游Rb的磷酸化以及細(xì)胞的凋亡，是目前研究較多的一種促癌因子[8]。本研究通過(guò)NCBI上查詢(xún)發(fā)現(xiàn)miR-154-3p上存在Smad7的結(jié)合位點(diǎn)，因此推測(cè)miR-154-3p可以通過(guò)靶向作用于Smad7 mRNA，下調(diào)Smad7表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)抑制癌細(xì)胞的進(jìn)展。通過(guò)熒光霉素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型miR-154-3p組熒光酶活性顯著低于突變體miR-154-3p組熒光酶活性，說(shuō)明miR-154-3p確實(shí)存在Smad7的結(jié)合位點(diǎn)，可以靶向作用降低Smad7的表達(dá)水平，為后續(xù)研究提供了一定理論基礎(chǔ)。

內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，以及誘導(dǎo)其凋亡可以防止血管生成，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤的發(fā)展[9-10]。因此本研究采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了HUVEC細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)相比Control組，miR-154-3p組細(xì)胞克隆形成率顯著降低，Smad7組細(xì)胞克隆形成率顯著升高。相比Smad7組，miR-154-3p+Smad7組細(xì)胞克隆形成率顯著降低。說(shuō)明miR-154-3p高表達(dá)可以抑制HUVEC細(xì)胞的增殖，而Smad7高表達(dá)則可以促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖，miR-154-3p+Smad7可以抑制HUVEC細(xì)胞的增殖，結(jié)合熒光霉素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-154-3p上存在Smad7的結(jié)合位點(diǎn)，可以得出miR-154-3p高表達(dá)可以靶向結(jié)合Smad7基因使得Smad7蛋白表達(dá)水平降低，從而實(shí)現(xiàn)抑制HUVEC細(xì)胞的增殖。張小平等[11]研究表明，Smad7的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，與本研究得出的結(jié)論一致。

抑制HUVEC細(xì)胞的增殖可以影響腫瘤的發(fā)展，HUVEC細(xì)胞的侵襲和遷移同樣會(huì)影響到腫瘤細(xì)胞的發(fā)展[12]。本研究為檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的侵襲能力，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了HUVEC細(xì)胞的侵襲能力，發(fā)現(xiàn)miR-154-3p高表達(dá)細(xì)胞的侵襲能力顯著降低，而Smad7高表達(dá)會(huì)使得HUVEC細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)，共轉(zhuǎn)組的HUVEC細(xì)胞的侵襲能力又有一定程度的減弱，結(jié)合前面研究，發(fā)現(xiàn)miR-154-3p上存在Smad7的結(jié)合位點(diǎn)，可以得出miR-154-3p可以靶向作用于Smad7 mRNA，干擾Smad7表達(dá)從而抑制HUVEC細(xì)胞的侵襲能力。為探究其機(jī)制，本文深入研究了與腫瘤細(xì)胞侵襲能力相關(guān)的蛋白表達(dá)情況。VEGF是一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)新血管的生長(zhǎng)[13]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)下調(diào)Smad7的表達(dá)可以顯著抑制其表達(dá)，說(shuō)明miR-154-3p靶向作用Smad7可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子達(dá)到抑制其增長(zhǎng)的效果。

腫瘤細(xì)胞的增殖與炎癥關(guān)系也較為密切，炎癥反應(yīng)參與了大多數(shù)腫瘤的發(fā)展過(guò)程[14]。炎癥因子包含促炎癥因子和抑炎癥因子兩大類(lèi)，促炎癥因子主要由TH1細(xì)胞分泌，包含TNF-α、IL-17、IL-23等[15]；而抑炎癥因子則由主要由TH2細(xì)胞分泌，包含IL-10、IL-4、IL-13等[16]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-154-3p高表達(dá)的相關(guān)抑炎癥因子表達(dá)升高，促炎癥因子表達(dá)降低，這也符合前面所得結(jié)論miR-154-3p高表達(dá)可以靶向作用Smad7的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)展。楊曉宇等[17]研究表明：炎癥因子在腫瘤的發(fā)展中起著重要的作用，抑制炎性因子的分泌可以一定程度上抑制腫瘤的發(fā)展。

綜上所述，miR-154-3p過(guò)表達(dá)可以靶向結(jié)合Smad7，有效抑制HUVEC的增殖和運(yùn)動(dòng)能力。