韓兆冬，鄧煜麟，馮源發(fā)，蔡尚樺，唐鎮(zhèn)鋒，鐘惟德

（廣州市第一人民醫(yī)院/華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州 510180）

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)位居男性惡性腫瘤第2位[1]。在我國，前列腺癌則位居發(fā)病率第6位，死亡率第10位，其5年生存率遠(yuǎn)低于美國[2]。隨著前列腺腫瘤早期篩查的推廣，更多的早期前列腺癌患者被確診，接受根治性切除手術(shù)治療后可獲得良好的預(yù)后。但仍有相當(dāng)多的患者在確診前列腺癌時(shí)已經(jīng)失去手術(shù)的機(jī)會，并且在接受內(nèi)分泌治療一段時(shí)間后，出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)，預(yù)后欠佳。因此，急需尋找新的生物標(biāo)記物為前列腺癌的早期治療提供新的治療靶點(diǎn)。

眾所周知，大多數(shù)癌細(xì)胞依賴于有氧糖酵解產(chǎn)生能量的Warburg效應(yīng)。然而，與大多數(shù)依賴有氧糖酵解的癌細(xì)胞不同，前列腺癌細(xì)胞與良性細(xì)胞相比，其表現(xiàn)出在線粒體中更活躍的檸檬酸循環(huán)活性[3]。為此，我們通過公共數(shù)據(jù)庫下載前列腺癌患者的腫瘤測序及臨床信息進(jìn)行分析，以探討線粒體基因與前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)的相關(guān)性，并分析其在前列腺癌生化復(fù)發(fā)中發(fā)揮作用的信號通路。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

TCGA公共數(shù)據(jù)庫（TCGA-PRAD，https://www.cancer.gov/tcga)下載498名前列腺癌患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。BROAD公共數(shù)據(jù)庫（https://www.broadinstitute.org/mitocarta）下載MitoCarta3.0數(shù)據(jù)集，其中包含1 135個(gè)編碼人類線粒體蛋白的基因。

1.2 基因篩選

通過生存分析篩選出生化復(fù)發(fā)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因，生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用在線生物信息學(xué)分析網(wǎng)站VENNY（https://bioin‐fogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)基因以及線粒體基因進(jìn)行交集分析，獲得具有前列腺癌生化復(fù)發(fā)意義的線粒體基因。

1.3 基因相關(guān)性分析

利用在線生物信息學(xué)分析網(wǎng)站STRING（https://string-db.org）分析篩選出來具有前列腺癌生化復(fù)發(fā)意義的線粒體基因之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。Cytoscape 3.7.2 軟件對STRING的結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的可視化并篩選出互作網(wǎng)絡(luò)中關(guān)系最密切的前20個(gè)基因。

1.4 基因富集及功能分析

利用網(wǎng)站METASCAPE（https://metascape.org），通過基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），對具有前列腺癌生化復(fù)發(fā)意義的線粒體基因進(jìn)行功能分析并預(yù)測其發(fā)揮作用的信號通路。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)相關(guān)的線粒體基因

在TCGA-PRAD公共數(shù)據(jù)庫中，篩選出3 035個(gè)與前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)的差異基因。為了探討線粒體相關(guān)基因在前列腺癌生化復(fù)發(fā)中的作用，結(jié)合MitoCarta3.0數(shù)據(jù)集中1 135個(gè)編碼線粒體蛋白的基因，使用VENNY網(wǎng)站進(jìn)行交集分析（圖1），結(jié)果提示有141個(gè)具有前列腺癌生化復(fù)發(fā)意義的線粒體基因，基因名如下：

圖1 篩選具有前列腺癌生化復(fù)發(fā)意義的線粒體基因Figure 1 Screening of mitochondrial genes for biochemical recurrence of PCa

ABAT、ABCB6、ABCB7、ACACA、ACAD11、ACAD8、ACAD9、ACOT13、ACSF3、ACSL6、ADCK5、AGK、AKR7A2、ALDH2、ALDH3A2、ALDH6A1、AL‐DH7A、ALKBH1、ALKBH7、ATPAF2、AURKAIP1、BCAT2、BCL2L11、BNIP3L、PRXL2A、CMC2、TEFM、SEPTIN4、SMDT1、NOA1、SMIM8、CA5B、CCDC127、CCDC51、CDK5RAP1、CLYBL、COM‐TD1、COMT、COQ9、COX4I1、COX6B2、CPOX、CPT1C、CPT2、CS、CYB5B、DAP3、DCXR、DGUOK、DHRS7B、DNA2、ECH1、ECHDC1、ECHDC3、ECHS1、ECSIT、EPHX2、FDX1、FKBP10、FKBP8、GCAT、GCDH、GDAP1、GLOD4、GLS、GSTZ1、GT‐PBP10、GTPBP3、HARS2、HIBADH、HINT2、HMG‐CL、HMGCS2、HSCB、HSDL1、HTRA2、IMMT、LETM1、LIG3、LRPPRC、MCAT、MCEE、MLYCD、MMAB、MOCS1、MPST、MRM1、MRPL17、MRPL20、MRPL40、MRPL54、MRPS18A、MRPS26、MSRA、MTHFD1L、MYO19、NDUFA13、NDUFA9、NDUFS5、NDUFV2、NGRN、NIPSNAP3B、NUDT8、OPA1、PARK7、PCCA、PDF、PGS1、PIF1、POLG2、POLQ、PPM1K、PPOX、PTCD1、PTCD3、PTPMT1、SARS2、SCP2、SLC25A11、SLC25A13、SLC25A36、SLC25A42、SLC25A43、SLC25A4、SOD2、SPRYD4、STX17、SU‐CLA2、TARS2、TFB2M、THEM4、TIMM22、TMEM11、TMEM14C、TMEM65、TRAP1、TST、TXN2、UCP3、VARS2、XPNPEP3。

2.2 前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)線粒體基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

首先利用STRING網(wǎng)站，初步得到上述141個(gè)基因之間的相互作用關(guān)系，再通過Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的可視化（圖2A），篩選出互作網(wǎng)絡(luò)中關(guān)系最密切前20個(gè)基因（圖2B、圖2C）分別是SOD2、CS、COX4I1、ECHS1、HMGCL、PTCD3、CPT2、NDU‐FA9、HIBADH、ALDH6A1、PARK7、PCCA、NDUFV2、MRPL17、DAP3、ACSF3、AURKAIP1、MRPL20、MD‐UFA13及MRPL40。

圖2 前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)線粒體基因之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。Figure 2 Protein-protein interaction network among mitochondrial genes related to biochemical recurrence of PCa

2.3 探究前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)線粒體基因發(fā)揮作用的機(jī)制

GO富集分析從生物學(xué)過程（圖3A）、細(xì)胞成分（圖3B）和分子功能（圖3C）3個(gè)方面預(yù)測這些基因的功能作用，結(jié)果顯示這些基因主要參與線粒體基質(zhì)和線粒體膜（圖3B，GO:0005759，GO:0031966，GO:0044455）的組成，影響線粒體的組成及其自身基因的表達(dá)，參與有機(jī)酸、脂肪酸等物質(zhì)的代謝（圖3A，GO:0007005，GO:0140053，GO:0016054，GO:0006631），調(diào)控氧化還原反應(yīng)（圖3C，GO:0016491）。KEGG分析結(jié)果顯示前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)線粒體基因發(fā)揮生物作用的12條信號通路中，篩選的基因主要參與丙酮代謝及脂肪酸代謝通路（圖4，ko00640，ko:00071，hsa01212）。

圖3 前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)線粒體基因的功能預(yù)測Figure 3 Function prediction of mitochondrial genes related to biochemical recurrence of PCa

圖4 KEGG預(yù)測前列腺癌生化復(fù)發(fā)相關(guān)線粒體基因富集的信號通路Figure 4 Prediction of the signaling pathway of mitochondrial genes related to biochemical recurrence of PCa by KEGGanalysis

3 討論

失去根治性手術(shù)治療機(jī)會的前列腺癌患者在接受抗雄激素的去勢治療初期，可以獲得癌灶縮小、前列腺特異性抗原（PSA）下降的良好治療效果。但大多數(shù)患者經(jīng)過內(nèi)分泌治療后出現(xiàn)雄激素維持在去勢水平，但PSA再次升高的情況，此時(shí)可認(rèn)為患者出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)的病情進(jìn)展，預(yù)后較差。

對腫瘤代謝的研究始于20世紀(jì)中葉，Warburg[4]提出惡性腫瘤細(xì)胞即使在充分的氧氣供應(yīng)下，葡萄糖優(yōu)先合成代謝為丙酮酸，然后再轉(zhuǎn)化為乳酸。此后，大量研究指出能量代謝異常在促進(jìn)腫瘤生成及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

良性前列腺細(xì)胞通過積累鋅抑制檸檬酸循環(huán)活動。然而，前列腺癌細(xì)胞并不依賴于有氧糖酵解以產(chǎn)生能量，反而通過消耗細(xì)胞內(nèi)的鋅以解除對檸檬酸循環(huán)的抑制作用[5]。為此，我們針對線粒體基因?qū)τ谇傲邢侔┥瘡?fù)發(fā)的意義進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有141個(gè)編碼線粒體蛋白的基因?qū)τ谇傲邢侔┗颊呱瘡?fù)發(fā)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其主要編碼線粒體基質(zhì)及線粒體膜等線粒體組分，提示線粒體結(jié)構(gòu)異?？赡苡绊懬傲邢侔┗颊呱瘡?fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。研究結(jié)果表明，調(diào)控線粒體形態(tài)變化將影響腫瘤的生長。調(diào)控肺癌細(xì)胞線粒體形態(tài)使其裂解狀態(tài)增強(qiáng)，可以導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯并抑制其在裸鼠中的生長[6]。此外，增強(qiáng)Hela細(xì)胞的線粒體裂解狀態(tài)，可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[7]。本研究通過富集分析發(fā)現(xiàn)上述基因主要富集在丙酮及脂肪酸代謝的生物進(jìn)程中，參與調(diào)控氧化還原活動。多項(xiàng)研究提示脂質(zhì)代謝異常可促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展，前列腺癌細(xì)胞通過過表達(dá)如脂肪酸合成酶（FASN）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP1）和固醇輔酶A去飽和酶等產(chǎn)生新生脂質(zhì)的關(guān)鍵蛋白[8]，也可以利用從頭合成的脂肪酸來獲得能量[9]。Yoshiii等[10]認(rèn)為前列腺組織中不受調(diào)控的FASN活性本身就是惡性表型的開始，并認(rèn)為是維持前列腺癌生長所必需的。通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)SOD2、CS、COX4I1、ECHS1、HMGCL、PTCD3、CPT2、NDUFA9、HIBADH、ALDH6A1、PARK7、PC‐CA、NDUFV2、MRPL17、DAP3、ACSF3、AURKAIP1、MRPL20、MDUFA13及MRPL40在此進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，但具體仍需要進(jìn)一步的研究。

上述結(jié)果表明，線粒體基因在前列腺癌生化復(fù)發(fā)中起著重要作用，這些基因調(diào)控線粒體的結(jié)構(gòu)，在功能上，其通過調(diào)控丙酮及脂肪酸代謝影響氧化還原反應(yīng)。此外，我們篩選了20個(gè)高相關(guān)性基因，可能成為潛在的早期診斷及治療的靶點(diǎn)。